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艰难梭菌毒素B羧基末端膜受体结合蛋白基因的克隆和表达

作　者: 刘博婷
导　师: 朱必凤；杨旭夫
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物学
关键词: 艰难梭菌 细胞毒素B膜受体结合区 克隆与表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 22次
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内容摘要


艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)是医院内肠道感染的主要致病菌。该菌引起艰难梭菌相关性疾病(Clostridium difficile-associated disease,CDAD)。CDAD首选治疗是口服甲硝唑或万古霉素,但各地近年来已经发现了艰难梭菌带有多种抗生素耐药基因,特别是临床已经分离出同时耐甲硝唑和万古霉素的菌株,这就预示着这些抗生素将对艰难梭菌感染治疗无效。本实验目的在于通过基因工程技术寻求探索防治CDAD的方法,为新型防治制剂的研究奠定基础。本课题利用艰难梭菌毒素B特点,以CD标准株VPI 10463的全长DNA序列为模板,利用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增出编码艰难梭菌毒素B羧基末端膜受体结合蛋白功能基因(CDB3),经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后,定向插入经这两种酶双酶切的原核表达载体pGEX-4T-1中,在T4 DNA连接酶作用下进行连接以获得重组质粒。重组质粒经测序结果与GenBank记录的CD VPI 10463的CDB3(bp5649-7496)基因序列相比对。将正确的重组子转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导表达出特异性蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白。获得如下结果;1.成功的培养了艰难梭菌,并提取了其基因组作为PCR反应模板。2.用自行设计的引物,通过PCR技术扩增出编码CDB3功能基因1848bp,引物在PCR反应中表现出很高的特异性,为理想的引物序列,PCR产物经测序与CD标准VPI 10463序列相应区域的基因相比对,确定为CDB3膜受体结合区域的功能基因。3.目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1连接后获得的重组质粒,测序结果与GenBank记录的CD VPI 10463的CDB3基因序列相比对符合率达100%。4.将经鉴定的阳性克隆子在IPTG的诱导下表达,然后进行8%SDS-PAGE电泳分析,结果发现,经诱导后表达的融合蛋白相对分子质量为97.7kDa,与预期的蛋白大小一致。5.融合蛋白用Western-blot证实,融合蛋白成功表达,为进一步研究CDAD的诊断试剂及基因重组疫苗奠定了重要的实验基础。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章 前言  11-20
  1.1 艰难梭菌概述  11-15
    1.1.1 艰难梭菌感染  11-12
    1.1.2 艰难梭菌毒素  12-13
    1.1.3 艰难梭菌诊断  13-14
    1.1.4 艰难梭菌防治  14-15
  1.2 艰难梭菌疫苗  15-19
    1.2.1 传统疫苗和存在问题  15
    1.2.2 基因工程疫苗  15-16
    1.2.3 大肠杆菌表达系统  16
    1.2.4 艰难梭菌疫苗研究概况  16-19
  1.3 选题意义  19-20
第二章 材料与方法  20-32
  2.1 材料  20-23
    2.1.1 主要仪器和设备  20
    2.1.2 菌种及质粒  20
    2.1.3 试剂  20
    2.1.4 溶液配制  20-23
    2.1.5 培养基  23
  2.2 方法  23-32
    2.2.1 艰难梭菌的培养  23
    2.2.2 艰难梭菌基因组 DNA的提取  23-24
    2.2.3 目的基因制备  24-26
    2.2.4 DNA酶切  26
    2.2.5 PCR产物和载体的连接  26-27
    2.2.6 制备的(大肠杆菌菌株)感受态细胞  27
    2.2.7 连接产物的转化  27
    2.2.8 阳性克隆子鉴定  27-29
    2.2.9 重组蛋白诱导表达  29-32
第三章 结果与分析  32-42
  3.1 艰难梭菌的培养  32
  3.2 目的基因PCR扩增  32-33
  3.3 PCR产物直接测序结果及序列分析  33-35
  3.4 质粒pGEX-4T-1-CDB3的构建  35-36
  3.5 重组质粒提取  36
  3.6 重组质粒限制性内切酶分析  36-37
  3.7 重组质粒pGEX-4T-1-CDB3序列分析  37-39
  3.8 重组蛋白诱导表达  39-40
  3.9 Western blot  40-42
第四章 讨论与结论  42-47
  4.1 讨论  42-46
    4.1.1 艰难梭菌培养  42
    4.1.2 克隆片段选择  42
    4.1.3 pGEX-4T-1载体  42-44
    4.1.4 DNA聚合酶  44
    4.1.5 双酶切  44-45
    4.1.6 重组蛋白诱导表达  45-46
  4.2 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
攻读学位期间的研究成果  52

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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