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新型断裂蛋白质内含子体外剪接动力学的研究

作　者: 李梦梦
导　师: 孟清；刘相钦
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 断裂蛋白质内含子反式剪接动力学体外反应
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蛋白质内含子(intein)是镶嵌在宿主蛋白质中的插入序列,在宿主蛋白质成熟过程中能够自我剪切下来,同时将两侧的序列—蛋白质外显子(exteins)通过肽键相连接,形成成熟的蛋白质。蛋白质的这一成熟过程被称为蛋白质顺式剪接(protein cis-splicing)。断裂蛋白质内含子(split-intein)是在蛋白质内含子内部区域特定位点发生断裂,形成N-端蛋白(IN)和C-端蛋白(Ic),分别由基因组上相距较远的两个开放阅读框(open reading frame, ORF)编码。在翻译后成熟过程中,IN和Ic相互识别,重建催化活性中心,介导蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)。通过人工改造断裂蛋白质内含子的断裂位点,使之靠近蛋白质内含子的N-末端或C-末端,即形成了新型断裂蛋白质内含子。断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接技术在蛋白质纯化、基因治疗、环状多肽制备以及大分子复杂蛋白质的生产方面已取得了一些成果。新型断裂蛋白质内含子在此基础上扩大了断裂蛋白质内含子的应用,提供了在目的蛋白质的N-末端或C-末端标记任意化学基团的潜力。在进行应用之前需要对这一反应的酶促动力学进行全面的了解,因而,新型断裂蛋白质内含子剪接动力学的研究显得十分重要。本课题选取新型断裂蛋白质内含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11进行剪接动力学的研究。本研究中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅含有11个氨基酸,S11型断裂蛋白质内含子的C端仅含有6个氨基酸,易于化学合成,可以应用于重组蛋白质或药物的N-末端或C-末端荧光素、生物素等标记。构建只含有N端前体蛋白或C端前体蛋白相应序列的表达质粒,麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)与IN组成的融合蛋白为N端前体蛋白；IC与硫氧还蛋白(thioredoxin, T)组成的融合蛋白为C端前体蛋白。利用N端前体蛋白带有的MBP标签可以与Amylose resin特异性结合,C端前体蛋白带有的6×组氨酸标签可以与Ni-NTA resin特异性结合,纯化得到用于后续体外反应所需的N端前体蛋白和C端前体蛋白。将纯化的N端前体蛋白与C端前体蛋白在摩尔比为1：1的条件下进行反应,通过Western印迹检测剪接反应的活性,结果表明,断裂蛋白质内含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11在体外均有剪接活性。将N端前体蛋白和C端前体蛋白两两组合进行体外交叉反应,除TX-S1N/SX-S1C组合外,其它组合均无交叉反应,为同时使用多个断裂蛋白质内含子对一个目的蛋白进行多段标记或对多个目的蛋白进行标记奠定基础。在不同的DTT的浓度、温度、氯化钠的浓度和pH值条件下,探索断裂蛋白质内含子剪接的最优化条件,结果表明,除反应体系中无DTT存在时,剪接效率明显下降甚至无剪接反应发生以外,其余条件对剪接反应影响较小。当N端前体蛋白与C端前体蛋白摩尔比为10：1混合时,动力学分析实验结果表明,断裂蛋白质内含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11体外剪接效率分别达到～96%、～50%、～93%和～87%,剪接速率常数分别为(2.68±0.39)×10-4 s-1、(2.19±0.33)×10-3 s-1、(3.94±0.91)×104 s-1和(3.43±0.59)×10-4 s-1。新型断裂蛋白质内含子在位点特异性蛋白标记的潜在应用,使蛋白质标记不再局限于传统的氨基酸特异性标记。新型断裂蛋白质内含子将在蛋白质工程、蛋白质药物开发和蛋白质结构与功能研究等方面有非常广泛的应用。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章绪论  11-27
  1.1 引言  11-12
  1.2 蛋白质内含子的发现  12-13
  1.3 蛋白质内含子的结构和分类  13-15
  1.4 蛋白质内含子的剪接机制  15-20
  1.5 蛋白质内含子的应用  20-24
  1.6 新型断裂蛋白质内含子  24-25
  1.7 课题研究的目的、内容和意义  25-27
第二章实验材料、基本技术和设计方案  27-43
  2.1 实验材料和仪器  27-35
  2.2 实验基本技术  35-42
  2.3 实验设计方案  42-43
第三章实验过程  43-55
  3.1 断裂蛋白质内含子表达质粒的构建  43-47
  3.2 前体蛋白质的纯化  47-51
  3.3 断裂蛋白质内含子的体外剪接、交叉反应和剪接条件的优化  51-53
  3.4 断裂蛋白质内含子的剪接动力学  53-55
第四章实验结果与分析  55-75
  4.1 断裂蛋白质内含子表达质粒的构建  55-58
  4.2 前体蛋白质的纯化  58-60
  4.3 断裂蛋白质内含子的体外剪接、交叉反应和剪接条件的优化  60-69
  4.4 断裂蛋白质内含子的剪接动力学  69-75
第五章结论  75-77
  5.1 结论  75-76
  5.2 创新点  76
  5.3 展望  76-77
参考文献  77-80
硕士期间参加科研情况说明  80-81
致谢  81

新型断裂蛋白质内含子体外剪接动力学的研究

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