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DR5在食管癌细胞失巢凋亡中的作用及机制

作　者: 蒋会娟
导　师: 王建华；刘广超
学　校: 河南大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 去粘附化 失巢凋亡 食管癌 死亡受体5
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景失巢凋亡是内皮及上皮细胞脱离细胞外基质发生细胞凋亡的一种特殊的死亡形式。其对于防止这些细胞于异处生长具有重要意义。在肿瘤转移过程中,转移的肿瘤细胞要多次脱离细胞外基质,因此失巢凋亡与肿瘤转移具有密切的关系,阐明其分子机制对于肿瘤及其转移的防治具有重要意义。目前,有关失巢凋亡的作用机制还不太清楚,有研究表明与死亡受体细胞凋亡信号转导途径具有一定的联系。死亡受体(death receptor, DR)5是死亡受体家族的重要成员,DR5是一良好的抗肿瘤作用靶点,其活化可转导细胞凋亡信号,在抗肿瘤方面具有重要的应用前景。有研究结果提示,DR5可能参与细胞的失巢凋亡,但有关确切作用有待证实,作用机制不清楚。研究目的明确DR5在食管癌细胞失巢凋亡中的作用,并阐明DR5在食管癌细胞失巢凋亡中的作用机制。研究方法将去粘附化的食管癌细胞悬浮培养。通过RNA干扰技术建立DR5基因沉默的食管癌细胞系。免疫细胞化学技术分析食管癌DR5表达及分布;利用流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5的表达、细胞凋亡、ROS及Ca2+。定量PCR技术检测DR5的基因表达。利用免疫印迹技术分析食管癌细胞的DR5表达、细胞色素C释放及capase活化;利用免疫共沉淀分析DISC;并利用乙酰半胱氨酸探讨ROS在食管癌细胞表面DR5的表达及细胞凋亡中的作用。研究结果1、建立了DR5基因沉默的食管癌细胞系;2、去粘附化过程中发生食管癌细胞凋亡,并具有时间依赖性;去粘附显著增强食管癌细胞对DR5的抗体诱导细胞凋亡的敏感性。3、去粘附化过程中,食管癌细胞内ROS水平、Ca2+浓度以及细胞膜DR5表达水平均升高,并具有时间依赖性,而且DR5基因表达增强;DR5基因沉默的食管癌细胞凋亡率、细胞内ROS水平、DR5表达较低。乙酰半胱氨酸对食管癌细胞DR5的表达、细胞凋亡、细胞内ROS均有抑制作用。4、酶免疫细胞化学及免疫荧光显示,在粘附铺展细胞中,DR5主要分布在细胞质中,在细胞核没有DR5分布,DR5以均质状主要分布在细胞核膜周围;而在未处理去粘附化细胞中,DR5也主要分布在细胞质,但以颗粒状靠近细胞膜分布。5、免疫印迹结果显示,失巢凋亡过程中有caspase 8/ caspase 9/ caspase 3的激活以及tBid的活化,并有细胞色素C的释放。6、免疫共沉淀结果显示,失巢凋亡过程中的形成了DISC,出现DR5及caspase 8。结论1、DR5参与了食管癌细胞的失巢凋亡过程并起主要作用。2、去粘附化主要通过ROS增强DR5表达及转运,并导致DR5寡聚化发生自我活化,从而激活死亡受体细胞凋亡信号转导途径诱导失巢凋亡的发生。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-11
1 引言  11-14
2 材料、试剂与仪器  14-24
  2.1 主要试剂及配制  14-22
  2.2 主要仪器  22-24
3 方法与步骤  24-44
  3.1 细胞培养  24
  3.2 制备DH5a 宿主菌感受态细胞  24-25
  3.3 细菌的转化  25
  3.4 质粒扩增和提取  25-26
  3.5 pDR5-siRNA 质粒双酶切鉴定  26-27
  3.6 食管癌细胞基因共转染及食管癌基因沉默稳定细胞系的建立  27-28
  3.7 基因转染对细胞生长的影响  28
  3.8 流式细胞术检测去粘附化对细胞成活的影响  28
  3.9 失巢凋亡的形态学观察  28-29
  3.10 失巢凋亡的亚二倍体分析  29
  3.11 失巢凋亡的DNALadder 分析  29-30
  3.12 流式细胞仪检测细胞凋亡  30-31
  3.13 流式细胞术检测细胞表面DR5  31
  3.14 免疫细胞化学法观察食管癌细胞DR5 表达分布  31-32
  3.15 免疫荧光方法食管癌细胞DR5 表达分布  32
  3.16 定量PCR 分析DR5 基因表达  32-33
  3.17 RT-PCR  33-35
  3.18 PCR 产物的定量分析  35
  3.19 流式细胞仪检测细胞内ROS  35-36
  3.20 流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位变化JC-1 方法  36-37
  3.21 流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度变化  37
  3.22 乙酰半胱氨酸对食管癌细胞ROS、DR5 表达、细胞凋亡及线粒体膜电位的影响  37-38
  3.23 细胞总蛋白的提取  38
  3.24 总蛋白定量（BCA 法）  38
  3.25 蛋白质凝胶电泳  38-40
  3.26 Western blotting 蛋白转印  40-42
  3.27 免疫共沉淀法分析DISC 复合物的形成  42-43
  3.28 数据处理及统计分析  43-44
4 结果  44-66
  4.1 DR5 基因沉默质粒的双酶切鉴定  44
  4.2 DR5 基因沉默细胞株的建立及鉴定  44-46
  4.3 去粘附化对细胞成活的影响  46-47
  4.4 EC109 细胞失巢凋亡的形态学变化  47-48
  4.5 食管癌细胞的亚二倍体分析  48-50
  4.6 流式细胞术分析食管癌细胞的失巢凋亡  50-52
  4.7 粘附化增强食管癌细胞对抗体mDRA-6 诱导凋亡的敏感性  52
  4.8 酶免疫细胞化学法观察食管癌细胞DR5 的分布  52-53
  4.9 免疫荧光法观察食管癌细胞DR5 的分布  53-54
  4.10 流式细胞术定量分析细胞表面DR5 表达  54-56
  4.11 去粘附对DR5 的基因表达的影响  56-57
  4.12 失巢凋亡过程中食管癌细胞的线粒体膜电位变化  57-58
  4.13 去粘附化状态下食管癌细胞内ROS 分析  58-59
  4.14 失巢凋亡过程中食管癌细胞内Ca2+分析  59-61
  4.15 乙酰半胱氨酸对食管癌细胞ROS、DR5 表达、细胞凋亡的影响  61
  4.16 失巢凋亡过程中Caspase 的免疫印迹分析  61-63
  4.17 细胞色素C 及Bid 的免疫印迹分析  63-64
  4.18 免疫共沉淀法分析DISC 复合物的形成  64-66
5 讨论  66-71
参考文献  71-75
结论  75-76
文献综述  76-85
附录  85-87
在读期间发表及参与的学术论文与研究成果  87-88
致谢  88

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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