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铜绿假单胞菌制剂抗胆管癌作用的实验研究

作　者: 张磊
导　师: 何建平；李继梅；杨福；李丽华
学　校: 昆明医学院
专　业: 外科学
关键词: 人胆管癌细胞裸鼠动物模型铜绿假单胞菌制剂
分类号: R735.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 23次
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内容摘要

目的：采用体外培养的人胆管癌细胞株QBC939及人胆管癌裸鼠皮下移植瘤模型作为实验对象,观察铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)对体外培养的人胆管癌细胞株QBC939及人胆管癌裸鼠皮下移植瘤模型生长抑制作用,探讨PA-MSHA对胆管癌生长抑制的作用机制,为胆管癌术后辅助治疗探索切实有效的新方法。方法：1.通过体外培养人胆管癌细胞株QBC939,测定细胞活力、细胞贴壁率,并于96孔板内,分别接种4×10~3／孔、6×10~3／孔、8×103／孔三个浓度的QBC939细胞株,MTT比色法测定6h、12h、24h、48h的OD值,绘制生长曲线,确定最佳细胞接种浓度及药物干预区间。MTT比色法测定不同时间、不同浓度PA-MSH对人胆管癌细胞株QBC939的增殖抑制率。倒置显微镜观察细胞形态学变化。琼脂糖凝胶电泳(DNA Ladder)检测细胞凋亡。流式细胞术检测PA-MSHA对其细胞周期的影响。2.用人胆管癌细胞株QBC939接种于裸鼠的腋窝皮下,建立人胆管癌裸鼠皮下移植瘤模型(对照组),分别用不同浓度的铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)作用于人胆管癌裸鼠皮下移植瘤(实验组),分别观察、测量裸鼠成瘤情况；计算肿瘤生长抑制率；HE染色光镜组织形态学观察裸鼠肿瘤组织形态学变化及裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织的病理形态学变化。结果：第一部分结果：本实验所用人胆管癌细胞株QBC939,在常规培养条件下呈贴壁生长,生长状态良好,每次传代前活力测定,存活率均>95%。检测不同时间点贴壁率,于2h、4h、6h、8h、10h、12h分别为20%、66%、80%、86%、91%、97%符合本实验要求,MTT测定的生长曲线提示按照8×10~3／孔的浓度接种于96孔板内,100μl培养液(含10%胎牛血清的EMDM)可提供足够的细胞生长空间及营养成分,使细胞于接种12小时后,适应新环境,逐渐进入快速繁殖期。本实验选取细胞接种于96孔板后的24h-72h之间的48小时内,该区间能够保证细胞始终处于一个稳定的对数生长期。在此实验基础上,MTT法检测不同浓度PA-MSHA对胆管癌细胞株QBC939的影响,结果提示,细胞生长抑制率具有时间和剂量依赖性。PA-MSH诱导人胆管癌QBC939细胞株凋亡作用的DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示：对照组未见有DNA断裂梯状带；PA-MSH组48h人胆管癌QBC939细胞株,均可见明显典型“梯”状条带,条带间隔为180bp-200bp及其整数倍。流式细胞术药物作用组可见典型的亚二倍体峰即凋亡峰(AP),且随浓度加大G2／M期比例明显增多,提示铜绿假单胞菌(PA-MSHA)制剂可诱导人胆管癌细胞株QBC939凋亡,使其细胞周期阻滞于G2／M期,影响细胞有丝分裂,抑制细胞增殖。第二部分结果：1.于接种14天后成功的建立了人胆管癌细胞株QBC939裸鼠移植瘤模型组(对照组)和PA-MSHA作用于人胆管癌QBC939细胞株裸鼠皮下移植瘤组(实验组)。2.PA-MSHA作用后的人胆管癌QBC939细胞株裸鼠皮下移植瘤(实验组)生长抑制作用的结果显示：全部裸鼠体表淋巴结及腹腔淋巴结未见转移,亦未见腹膜转移及腹水；PA-MSHA作用于人胆管癌QBC939细胞株移植瘤(实验组)后体积和瘤重明显小于对照组,有显著差异(P<0.01)；有统计学意义。3.病理组织形态学HE染色结果显示：肿瘤组织中,细胞特点与原细胞株基本一致。PA-MSHA作用后的人胆管癌QBC939细胞株移植瘤组,肿瘤组织发生改变,均出现瘤组织中癌细胞密度减少,伴纤维化改变,部分癌巢发生程度不等片状坏死。各组裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织,亦均未见转移灶。结论：1.药物浓度为2-6×10~8cfu／ml的铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)作用体外人胆管癌QBC939细胞株48h后具有明显的增殖抑制作用。2.铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)能够诱导人胆管癌细胞株QBC939凋亡。3.铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)能够使人胆管癌QBC939细胞株移植瘤体积缩小,重量减轻,对人胆管癌QBC939细胞株裸鼠皮下移植瘤增长具有抑制作用。4.铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)能够使裸鼠移植瘤癌细胞密度减少,部分癌巢发生程度不等片状坏死,抑制人胆管癌QBC939细胞株移植瘤的生长。5.铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)对荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织形态结构无明显影响。6.铜绿假单胞菌制剂(PA-MSHA)可能是有前景的抗胆管癌药物。

全文目录

中英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
引言  10-12
第一部分  12-36
  一、材料和方法  12-20
  二、结果  20-29
  附录(主要溶液的配制)  29-31
  三、讨论  31-35
  四、结论  35-36
第二部分  36-46
  一、材料与方法  36-38
  二、结果  38-44
  三、讨论  44-45
  四、结论  45-46
全文结论  46
展望  46-47
参考文献  47-50
文献综述  50-55
攻读硕士期间发表文章情况  55
攻读硕士研究生期间获奖情况  55-56
致谢  56

铜绿假单胞菌制剂抗胆管癌作用的实验研究

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