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苯并[a]芘暴露的小鼠原代支气管上皮细胞中miR-320和miR-494对细胞周期的影响

作　者: 段慧菡
导　师: 蒋义国
学　校: 广州医学院
专　业: 卫生毒理学
关键词: 苯并[a]芘原代细胞培养支气管上皮细胞细胞周期 miR-320 miR-494
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA。成熟的miRNA大小在19~23个寡核苷酸(nucleotide ,nt)左右,其与靶基因mRNA 3’UTR上靶序列碱基配对,在转录后水平抑制蛋白质翻译或降解mRNA,是发挥功能的基础。miRNA对基因表达的调控现象在真核生物中广泛存在,不同的组织器官、不同类型的肿瘤、肿瘤的不同发展阶段都存在不同的miRNA的表达,使miRNA表达谱具有组织细胞特异性。苯并[a]芘(B[a]P)是常见的环境污染物,在生产和生活中有许多的暴露机会,也是吸烟相关肺癌的发展中起关键作用的成因之一。肿瘤是一类细胞周期性疾病,致癌作用被看作是细胞周期内在机制紊乱的结果。细胞周期存在多个检查点(checkpoint)调节各期间的转换及细胞周期进程。在课题组前期工作中,已发现miR-320和miR-494在anti-BPDE转化的人类支气管上皮细胞中表达最高。本实验选择miR-320和miR-494 ,以B[a]P染毒小鼠原代支气管上皮细胞,首次探索了miR-320和miR-494在B[a]P染毒细胞的细胞周期中的作用。方法小鼠原代支气管上皮细胞的培养在无菌条件下处死小鼠,取出支气管,立即置于预冷的Collection培养基中;移入PBS液中去除周围结缔组织及血管并纵向切开。用Dissociation培养基4°C消化24h加入Culture培养基轻柔地上下倒置管子12次,重复操作一次。离心,用Culture培养基重悬细胞。将此细胞悬液接种于60mm的培养皿中,2h后收集未贴壁细胞。将细胞接种于已用胎盘胶原包被的24孔板内,用Culture培养基在正常培养条件下,37°C、5% CO2下培养24h。次日弃去Culture培养基,添加Differentiation培养基,37°C、5% CO2下培养。原代细胞的染毒B[a]P粉末溶于DMSO中,细胞培养液中DMSO的终浓度不超过0.1%。用经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆微粒体酶系(Co-factor supplemented post-mitochondrial fraction, S9)并加相应的辅助因子(6-磷酸葡萄糖、辅酶II)配制成体外代谢活化系统。S9混合液随配随用。原代细胞在无血清培养的第二天,分别用0.01μM, 0.10μM和1.00μM并加S9活化的B[a]P无血清培养基染毒细胞,分别作用12h、24h、48h后弃去染毒液,PBS洗涤,继续在正常培养条件下无血清培养。原代细胞的转染转染实验步骤按照Hiperfect转染试剂24孔板转染操作指南进行。miR-320和miR-494抑制物(anti-miR-320,anti-miR-494)在反应体系的终浓度为30nmol/L,转染培养24h后可弃去培养基。用荧光素FAM标记的阴性对照检测抑制物的转染效率可达90%~95%。QRT-PCR检测miR-320和miR-494的表达用Trizol抽提各组样本的总RNA。按下列成分分别组成20μl miR-320、miR-494及18s rRNA的定量PCR反应体系: 10μl 2×Real-time PCR Master Mix, 1.6μl miRNA specific primer set (20μM), 2μl cDNA template, and 0.2μl Taq DNA聚合酶(5U/μl),加d3H2O至20μl。执行如下程序:95℃3min,95℃30s,62℃40s,循环40次。以18s rRNA作为内参照,采用2-△△Ct法对基因表达进行分析。流式细胞仪检测细胞周期的分布将细胞悬液离心,加入缓冲液重悬细胞,参照Cycle TEST Plus DNA reagent试剂盒说明书进行染色。FACSArray流式细胞仪分析细胞DNA含量,并应用Modfit LT 3.0软件分析细胞周期。流式细胞仪检测CDK6的表达水平采用间接免疫荧光标记法进行免疫荧光染色。一抗37°C孵育30min,用缓冲液洗涤2次后加二抗37°C避光孵育30min;缓冲液洗涤、重悬细胞。用FACSArray流式细胞仪进行CDK6含量的检测。以荧光指数(fluorescence index ,FI)表示CDK6的相对含量。7.统计学方法实验数据均以均数±标准差表示,采用SPSS 15.0统计软件处理,采用独立样本t检验进行数据分析,P < 0.05为差异有统计学意义。结果1. miR-320和miR-494在B[a]P暴露的小鼠原代支气管上皮细胞的表达分别以0.01μM、0.10μM和1.00μM的B[a]P并加S9活化染毒细胞。各剂量组B[a]P分别作用12h, 24h及48h后,miR-320和miR-494表达水平均有不同程度的上调。其中,1.00μM组的miR-320和miR-494表达均显示出明显的时间依赖关系。选取1.00μM B[a]P作用24h的条件进行后续的实验。2. miR-320和miR-494表达水平的有效抑制miR-320和miR-494的抑制物能分别特异有效地抑制miR-320和miR-494的表达。与B[a]P组相比,miR-320的表达水平在anti-miR-320组降低96.7%,差异显著(P <0.01);而在anti-miR-494组却无明显的变化,差异无统计学意义(P >0.05);同样地,miR-494的表达水平在anti-miR-494组明显地下调98%,差异显著(P <0.01);而在anti-miR-320组变化不明显,差异无统计学意义(P >0.05)。3. miR-320和miR-494对染毒细胞细胞周期的影响小鼠原代支气管上皮细胞经过1.00μM B[a]P作用24h后,出现了G1期阻滞的现象。与溶剂对照组的62.70%±1.54%的G1期细胞比例相比,B[a]P组细胞周期的进程被阻滞,84.28%±0.36%的细胞停留在此间期,差异具有统计学意义(P <0.05)。在分别转染了miR-320和miR-494的抑制物的anti-miR-320组和anti-miR-494组中,G1期细胞比例分别降低至60.57%±3.41%和57.52%±2.43%,与B[a]P组相比差异均有统计学意义(P <0.05)。而在anti-miR-nc组里,G1期细胞比例无明显的改变。4. miR-320和miR-494对染毒细胞CDK6表达水平的调控细胞经过1.00μM B[a]P染毒处理24h后,与溶剂对照组相比,CDK6的表达值由0.86±0.06降低至0.41±0.03,下降幅度达52.3%,差异显著(P <0.01)。而在分别转染了miR-320和miR-494的抑制物作用24h后,anti-miR-320组和anti-miR-494组均出现CDK6表达水平的恢复,与B[a]P组相比,CDK6的表达量分别有2.0±0.3与2.1±0.6倍的升高,差异具有统计学意义(P <0.01)。结论1.用冷消化和无血清培养的方法成功培养了小鼠原代支气管上皮细胞。2. miR-320和miR-494在B[a]P暴露的小鼠原代支气管上皮细胞中表达增高。3. miR-320和miR-494的高表达促使细胞G1期阻滞。4. miR-320和miR-494在一定程度上通过对CDK6表达的调控影响B[a]P暴露的细胞的细胞周期。本项目特色与创新:在国际毒理学研究领域,较早开展了miRNA研究;首次在原代培养细胞中研究miRNA,并发现miR-320和miR-494对细胞周期的调节作用。

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英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-14
前言  14-16
材料与方法  16-23
结果  23-29
讨论  29-31
结论  31-32
参考文献  32-35
综述  35-42
完成与发表论文  42-43
致谢  43-44

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