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宇佐美曲霉木聚糖酶基因的改造及表达

作　者: 孙军亭
导　师: 邬敏辰
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 木聚糖酶热稳定性 N端替换定点突变三维结构
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 73次
引　用: 1次
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内容摘要

宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)木聚糖酶(XynII)是G/11家族高比酶活木聚糖酶的一种,来源于Thermomonospora fusca的木聚糖酶(TfxA)也属于G/11家族的耐高温木聚糖酶。本研究以XynII为母体通过与TfxA N端替换拟提高XynII的耐热性,研究结果表明,N端替换后的重组蛋白XynIIAB失去了木聚糖酶活性;比较XynII、TfxA和XynIIAB的三维结构,发现XynII和TfxA空间位置第6位氨基酸残基都是芳香族氨基酸(Tyr或Phe),但在XynIIAB中失去了这一空间位置。为考察第6位芳香族氨基酸对酶活性的影响,设计实验将XynII第6位酪氨酸定点突变为丝氨酸(Ser)。研究结果发现,突变后的重组蛋白XynIIY6S同样无木聚糖酶活性;进一步对已报道的20种G/11家族木聚糖酶进行三维建模,发现它们在上述的空间位置都是芳香族氨基酸。由此可见,XynII无论是N端替换或定点突变,由于均失去了空间位置上保守的Tyr或Phe,从而导致酶活性的丧失。对宇佐美曲霉木聚糖酶XynII进行S179C定点突变。测定结果表明,突变酶XynIIS179C的最适反应温度由原酶的50℃提高到52℃;50℃热处理,半衰期由原酶的23 min延长到70 min,热稳定性是原酶的3倍;最适反应pH无变化。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章绪论  7-14
  1.1 木聚糖酶概述  7-8
    1.1.1 木聚糖概述  7
    1.1.2 木聚糖酶概述  7-8
  1.2 木聚糖酶的应用  8-9
    1.2.1 木聚糖酶在食品、饲料、酿酒工业上的应用  8-9
    1.2.2 木聚糖酶在造纸、纺织工业上的应用  9
  1.3 木聚糖酶基因的克隆与表达现状  9
  1.4 木聚糖酶热稳定性方面的研究  9-11
    1.4.1 热稳定区、盐桥、二硫键  10
    1.4.2 芳香族氨基酸、精氨酸、脯氨酸的含量  10-11
    1.4.3 一些保守的氨基酸  11
  1.5 木聚糖酶基因改造的方法  11-12
    1.5.1 定点突变  11
    1.5.2 定向进化  11-12
    1.5.3 DNA 改组  12
  1.6 课题意义  12
  1.7 立题依据  12-13
  1.8 课题内容  13-14
第二章材料与方法  14-28
  2.1 材料  14-16
    2.1.1 菌株与载体  14
    2.1.2 工具酶、试剂和引物  14-16
  2.2 方法  16-28
    2.2.1 表达载体的构建  16-23
    2.2.2 载体在宿主菌中的表达  23-24
    2.2.3 大肠杆菌中表达酶粗酶液的获得及SDS-PAGE 电泳样品的制备  24
    2.2.4 大肠杆菌中表达粗酶液酶活性的测定  24-25
    2.2.5 重组酶在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE 电泳  25-26
    2.2.6 毕赤酵母中表达木聚糖酶 XynII_(S179C) 的Sephadex G-50 纯化  26
    2.2.7 毕赤酵母中表达突变木聚糖酶 XynII_(S179C) 的SDS-PAGE  26
    2.2.8 突变酶XynII_(S179C) 与原酶XynII 最适反应pH 值的比较  26-27
    2.2.9 突变酶XynII_(S179C) 与原酶XynII 最适反应温度的比较  27
    2.2.10 突变酶XynII_(S179C) 与原酶XynII 50℃热稳定性的比较  27-28
第三章结果与讨论  28-42
  3.1 结果  28-35
    3.1.1 表达载体的构建  28-30
    3.1.2 载体表达的SDS-PAGE 检验及酶活性测定  30-32
    3.1.3 毕赤酵母表达突变木聚糖酶XynII_(S179C) 的Sephadex G-50 纯化及检验  32-33
    3.1.4 酶学性质比较  33-35
  3.2 讨论  35-42
    3.2.1 融合木聚糖酶XynIIAB 在大肠杆菌中的表达  35-36
    3.2.2 突变木聚糖酶XynIIY65 在大肠杆菌中的表达  36-38
    3.2.3 突变木聚糖酶XynII_(S179C) 在大肠杆菌中的表达  38-39
    3.2.4 突变木聚糖酶XynII_(S179C) 在毕赤酵母G5115 中的表达  39-42
第四章结论与展望  42-43
  4.1 结论  42
  4.2 展望  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-47
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  47

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的改造及表达

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