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绿色荧光蛋白融合表达法研究黄瓜α-半乳糖苷酶亚细胞定位

作　者: 汤雪燕
导　师: 曹碚生
学　校: 扬州大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 黄瓜 α-半乳糖苷酶 EGFP 亚细胞定位
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 199次
引　用: 2次
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内容摘要


黄瓜(Cucumis sativus L.)以水苏糖作为体内同化物的主要运输形式,但其果实中却只含有蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖。经韧皮部远距离运输而来的水苏糖到达库器官后,如何卸载并转化为蔗糖这一生理学过程一直不明。在亚细胞水平研究水苏糖分解为蔗糖过程中的关键酶—α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)的空间表达模式可为阐明该问题提供重要线索。为此,本实验构建了由CaMV 35S启动子调控的、2种黄瓜α-半乳糖苷酶的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)融合表达载体。运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,以质粒pCambia 1303为模板扩增了CaMV 35S启动子序列;以质粒pEGFP-N1为模板扩增了EGFP编码序列;运用反转录聚合酶链式反应(Reverse transcript–PCR, RT-PCR)技术,以黄瓜总RNA为模板扩增了黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ或碱性α-半乳糖苷酶Ⅰ编码序列。将上述三个片段插入表达载体pCambia 1381*c的多克隆位点,分别构建了EGFP位于目的基因C端的2个α-半乳糖苷酶基因-EGFP融合表达载体。基因枪法将上述经测序验证的2个表达载体分别导入洋葱表皮和黄瓜愈伤组织细胞,共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况。结果表明黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ在包括液泡在内的整个细胞中均有表达,而黄瓜碱性α-半乳糖苷酶Ⅰ在细胞核和细胞周边表达。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
引言  10-11
第一章 文献综述  11-26
  1 GFP 的研究历史  11-12
  2 GFP 的结构和光谱特性  12-15
    2.1 GFP 的分子结构  12-14
    2.2 GFP 的发光机制  14
    2.3 GFP 的光谱特性  14-15
  3 GFP 作为报告基因的优点  15-17
    3.1 检测方便，荧光性质稳定  15
    3.2 易于构建载体  15-16
    3.3 可直接用于活体测定  16
    3.4 共用性和通用性  16
    3.5 不受假阳性干扰，灵敏度高  16-17
    3.6 可制成永久标本  17
    3.7 易于得到突变体  17
  4 影响GFP 表达强度的因素  17-18
    4.1 表达温度对GFP 荧光强度的影响  17
    4.2 酸碱度对GFP 荧光强度的影响  17-18
    4.3 化学试剂对GFP 荧光强度的影晌  18
    4.4 表达时间对GFP 荧光强度的影响  18
  5 对GFP 的遗传改进  18-19
    5.1 更换GFP 生色团氨基酸  18-19
    5.2 改变碱基成分  19
    5.3 改变GFP 基因序列  19
  6 绿色荧光蛋白在生物技术中的应用  19-24
    6.1 分子标记  19-21
    6.2 生物传感器  21-22
    6.3 药物筛选  22-23
    6.4 基因表达的定量分析  23
    6.5 新型免疫标记物  23-24
  7 存在的问题及展望  24-26
第二章 2 种黄瓜α-半乳糖苷酶基因-EGFP 融合表达载体的构建  26-48
  1 实验材料  26-28
    1.1 植物材料  26
    1.2 引物、试剂及载体  26-28
  2 实验方法  28-41
    2.1 质粒的提取  28-29
    2.2 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备  29-30
    2.3 黄瓜α-半乳糖苷酶-EGFP 融合表达载体的构建  30-41
  3 结果与分析  41-48
    3.1 重组质粒①的验证分析  41-42
    3.2 重组质粒②的验证分析  42-44
    3.3 重组质粒③的验证分析  44-48
第三章 黄瓜α-半乳糖苷酶基因的亚细胞定位分析  48-55
  1 实验材料  48
    1.1 植物材料  48
    1.2 主要试剂  48
  2 实验方法  48-52
    2.1 试剂盒法提质粒③  48-49
    2.2 植物材料的准备  49
    2.3 金粉制备  49-50
    2.4 微弹制备  50
    2.5 基因枪（BioRad PDS-1000/He）瞬时转化与观察  50-52
  3 结果与分析  52-55
讨论  55-57
参考文献  57-65
致谢  65

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 瓜类 > 黄瓜
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