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耐高温α-淀粉酶是最早实现了工业化生产并且迄今为止用途最广、产量最大的一个酶制剂品种。它被广泛应用于纺织退浆、发酵、制糖等高温条件下生产工业。耐热耐酸的α-淀粉酶因其在工业生产中的重要作用而引起了研究者的关注。本论文在已对嗜热球菌Thermococcus siculi HJ21的α-淀粉酶基因TSA进行克隆表达的基础上,构建其点突变文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究。以研究室已构建的pET28a(+)-TSA为模板,设计含寡核苷酸序列的引物,分别对TSA的第98,109,121,125,157和184位氨基酸进行定点饱和突变,获得各单点突变体库。将该突变体库转化入大肠杆菌BL21进行表达。筛选突变体测序和进行α-淀粉酶活性检测。突变体K98R,A109V,Y121S,V125L,Y184H的酶活高于TSA,而突变体A157V的酶活低于亲本TSA。Y184H突变株酶活性较原始菌株提高1.8倍,突变K98R,A109V,Y121S,V125L均使酶活性有一定幅度的提高,突变A157V则使酶活性降低48%。经过对酶活力提高的突变位点的重组和筛选,获得高酶活突变体TSAM-23,其酶活是TSA的4.75倍,共发生5处突变:K98R,A109V,Y121S,V125L,Y184H。TSAM-23与未突变酶TSA的最适温度一样,都是90℃。与TSA相比,突变酶TSAM-23的热稳定性提高了12.8%(90℃,不加Ca2+),最适反应pH为5.0降低了0.5。突变酶更利于工业应用。对TSAM-23的457个氨基酸序列进行同源建模,预测其空间结构和酶活性中心处的催化氨基酸。
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