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骨组织工程中细胞三维培养力学环境的研究

作　者: 徐晓莹
导　师: 张西正
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物医学工程
关键词: 骨组织工程生物力学生物模型重建有限元方法生物学响应
分类号: R318
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究目的:结合高分辨率的显微CT成像系统(micro-CT)和有限元方法探索非侵入性生物建模,用于模拟骨组织工程中种子细胞在支架材料上三维培养的力学环境,并计算种子细胞与支架材料复合物的局部应变值;选用牛松质骨制备组织工程支架材料,负载成骨细胞在体外三维培养,并对种子细胞与支架材料复合物动态施加1000με和2000με生理范围的表观压缩应变,研究成骨细胞在此生理范围的力学刺激下的生物学响应,验证建模计算的结果,以探索通过工程建模分析来研究骨组织工程中微观力学环境和生物学响应的可行性。内容与方法:骨重建和骨塑建的力学响应机制表明,力学因素在骨的组织工程化构建中起着十分重要的作用。在骨组织工程中,外部力学载荷导致种子细胞和支架材料复合物内部的力学微环境发生变化,对细胞的增殖、迁移、细胞外基质的合成、细胞因子及激素分泌能力以及骨髓间充质干细胞的分化方向等起着重要的调控作用。因此,在骨组织工程构建过程中,细胞三维培养的力学微环境是有待深入研究的重要内容。近年来引入的三维有限元分析方法以及非侵入性高分辨率的Micro-CT影像技术使在细观层次上进一步探索培养物内部的微观力学条件成为可能。在此基础上对组织工程化骨内部的应力应变进行定量分析,在许多方面都具有重要的作用,例如研究由于骨质疏松、骨性关节炎、体内植入物降解以及细胞的活动造成的骨重建过程而引发的骨失效机制。脱钙骨基质能够促进细胞的黏附、增殖和分化,并且具有诱导成骨作用。利用Micro-CT对制备的支架材料进行扫描,获得该种支架材料的二维连续断层图像,同时,扫描过程中测量并提取被测样品的以下结构参数:骨体积分数(BV/TV)、骨表面积体积比(Bone surface/bone volume ratio,BS/BV)、骨小梁厚度(Trabecular thickness,TbTh)、骨小梁数目(Trabecular number,TbN)、轴向平均截距(MIL)、欧拉值(Euler Number)结构模型指数(Structure Model Index,SMl)和各向异性程度(degree of anisoropy,DA)。数据以(?)±s表示,采用SPSS11.5统计分析软件处理数据,组间差异比较采用单因素方差分析,P＜0.05为有显著性差异。生物体的建模一直是困扰生物力学分析的难题,囚为生物体的模型非常复杂,通常的CAD软件建模需花费大量的时间,且只能对规则形状数模进行建模。目前专用于医学影像数据三维建模的软件已经可以在一定程度上解决该问题,这类软件是基于医学影像设备输出的DICOM文件格式数据进行三维数模的建模,如CT和MR等设备。通过基于CT、MR的三维数模数据融合可构建复杂模型,同时,能够通过支架材料的灰度值计算弹性模量,这使生物建模不再依赖于建模时各向同性的理论假设,提高了建模的精确度,结果优于已有的以均一性假设为前提的研究。为了模拟种子细胞与支架材料复合物培养过程中的力学环境,本研究采用有限元方法,在力学分析软件中分别对两组重建模型施加与生物实验相同的1000με和2000με的表观面载荷,完成计算,并得到支架材料模型内部的应变分布云图。在本研究的生物实验中,以脱钙松质骨作为组织工程支架材料,负载成骨细胞在体外三维培养,采用自行研制的压载设备对细胞与支架材料的复合物进行力学刺激,细胞培养单元的实际工作应变大小和频率均可事先设定,也可以实时电脑控制,在可输出的应变范围0～2500με内可精确监测。将种子细胞与支架材材料的复合物分为两组,分别施加生理范围的1000με和2000με的力学刺激,加载频率为3Hz,每天加载8分钟,于第五天检测细胞的生物学响应。研究结果:本研究制备的牛松质骨经过一系列理化处理,具有天然孔隙结构,机械强度或弹性模量与天然组织相符,实验证实细胞多方向生长,具有较高的生物相容性和生物安全性,因此是良好的骨组织工程支架材料。结构参数为评价牛松质骨支架材料的结构、力学特性提供了重要的参考。研究结果表明,除欧拉值外,样品的其余四个参数均服从正态分布,牛松质骨作为支架材料其力学特性稳定,结构差异不大,具有良好的力学强度,结构的各向异性程度较小。本文探索了对CT扫描二维断层图像重建的模型进行网格划分和优化的过程,结果表明网格划分时三角形边长的确定与扫描的分辨率密切相关。在普通工作站计算时,平均划分单元数应不多于70万个左右,这样易于控制网格质量,并且能够顺利导入有限元计算软件进行模拟加载,否则严重占用系统资源,耗时过长,难于进行网格优化和力学分析。输入已有的材料密度与弹性模量的函数关系,得到模型的弹性模量分布,该部分材料属性信息导入力学计算软件代替了原有的各向同性假设,并且直接影响计算模型内部的力学响应。计算结果表明,1000με组内部平均80%单元的应变值小于800με,2000με组材料内部平均75%单元的应变值小于1500με,且单元数量的分布随着应变值的增大呈依赖性减少。两组样品在骨小梁处均存在应力集中现象。生物实验验证结果表明:(1)成骨细胞生长形态良好,呈多方向生长,骨小梁处细胞有聚集现象。(2)由于超过半数的支架材料单元局部应变小于400με,细胞对此力学信号的传导不敏感,对照组和加载组细胞的增殖不受力学加载的影响而碱性磷酸酶ALP水平随载荷增大而降低,并且2000με组下降大于1000με组。(3)力学加载直接影响细胞形态,对照组成骨细胞多为长梭形,加载组成骨细胞则呈类圆形,提示成骨细胞与支架材料复合,在生理应变范围内短期加载,促进成骨细胞的黏附,并趋于向骨细胞转化。研究结论:支架材料的三维重建是一个调用多个工具进行重复修整优化的手工流程,具有很高的灵活性,本研究引入材料的弹性模量即密度信息,材料内部应变的量化和分布合理,最终建立的三维模型的质量能够满足有限元力学分析软件进行后续计算的要求。因此本研究结合工程建模分析的方法探索骨组织工程中微观力学环境和生物学响应,是一种较为有效的途径。

全文目录

摘要  6-9
ABSTRACT  9-11
缩略词索引表  11-12
第1章绪论  12-16
  1.1 骨组织工程构建的回顾  12-13
    1.1.1 骨组织工程理论与实践  12
    1.1.2 骨组织对力学感知和传导机理  12-13
  1.2 细胞三维培养的力学环境  13-14
    1.2.1 有限元方法计算培养物内部受力的原理  13
    1.2.2 骨组织工程构建国内外研究现状  13-14
  1.3 选题意义与目的  14-15
  1.4 课题实施方案  15-16
第2章成骨细胞的分离培养和鉴定  16-22
  2.1 引言  16
  2.2 方法与结果  16-20
    2.2.1 材料  16
      2.2.1.1 动物  16
      2.2.1.2 试剂  16
    2.2.2 实验步骤与结果  16-20
      2.2.2.1 试验试剂的配制  16-17
      2.2.2.2 成骨细胞分离培养  17-18
      2.2.2.3 成骨细胞的纯化与鉴定  18-20
  2.3 讨论  20
  2.4 结论  20-22
第3章骨组织工程支架材料制备  22-27
  3.1 引言  22
  3.2 方法与结果  22-25
    3.2.1 支架材料的选取  22-23
    3.2.2 材料与试剂  23
      3.2.2.1 原料  23
      3.2.2.2 试剂  23
    3.2.3 生物衍生骨支架材料的制备  23-24
    3.2.4 松质骨支架材料的物理化学性质  24-25
      3.2.4.1 支架材料的毒性检验  24-25
      3.2.4.2 生物衍生骨支架材料的力学性能  25
  3.3 讨论  25-26
  3.4 结论  26-27
第4章支架材料的扫描成像及三维重建  27-35
  4.1 引言  27-28
    4.1.1 断层扫描原理及CT图像的形成  27-28
      4.1.1.1 断层扫描原理  27
      4.1.1.2 CT图像形成过程  27-28
  4.2 方法与结果  28-33
    4.2.1 扫描方法和仪器  28-29
      4.2.1.1 方法  28
      4.2.1.2 仪器与软件  28-29
    4.2.2 支架材料的微观结构及三维成像  29-30
      4.2.2.1 支架材料的微观结构  29-30
    4.2.3 支架材料的三维模型重建  30-32
    4.2.4 材料属性的确定  32-33
  4.3 讨论  33-34
  4.4 结论  34-35
第5章支架材料的有限元分析  35-43
  5.1 引言  35-38
    5.1.1 骨的力学感知、传导机理  35-38
      5.1.1.1 骨的力学感知机制  35-37
      5.1.1.2 骨的力学传质机理  37-38
  5.2 方法与结果  38-42
    5.2.1 有限元方法基本原理  38-39
    5.2.2 建立有限元模型  39-40
    5.2.4 有限元模型的参数设定  40
    5.2.5 有限元模型的计算与结果分析  40-42
  5.3 讨论  42
  5.4 结论  42-43
第6章复合物在力学环境下的培养及其生物学检测  43-54
  6.1 引言  43-44
  6.2 方法与结果  44-52
    6.2.1 细胞与支架材料复合  44
      6.2.1.1 松质骨支架实验选取  44
      6.2.1.3 负载成骨细胞  44
    6.2.2 种子细胞与支架材料复合物加载  44-46
      6.2.2.1 骨组织工程化培养加载装置的设计与应用  44-46
      6.2.2.2 复合物加载培养  46
    6.2.3 成骨细胞对力学加载的生物学响应  46-52
      6.2.3.1 细胞增殖数量、功能和形态学检测  47
      6.2.3.2 加载后细胞的免疫组化检测  47-50
      6.2.3.3 MTT法及ALP细胞活性检测  50-51
      6.2.3.4 组织切片检测  51-52
  6.3 讨论  52-53
  6.4 结论  53-54
第七章全文总结  54-56
  7.1 全文主要结论  54-55
    7.1.1 小鼠成骨细胞原代培养的结论  54
    7.1.2 生物支架材料评价方面的结论  54
    7.1.3 支架材料三维建模和力学分析的结论  54
    7.1.4 加载装置的使用和细胞三维培养的生物学响应的结论  54-55
  7.2 本研究的创新点  55-56
参考文献  56-62
文献综述  62-74
在学期间取得的成果及发表的代表性论著  74-80
  代表性成果  74-75
  代表性论著全文  75-80
作者简历  80-81
致谢  81

骨组织工程中细胞三维培养力学环境的研究

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