学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

伯克氏菌E264连续吸附耦合发酵生产Thailandepsin A的研究

作　者: 钟鸣
导　师: 张雪洪
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物学
关键词: 伯克氏菌E264 Thailandepsin A HP-20大孔吸附树脂连续吸附耦合发酵加料分批培养
分类号: X703
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 43次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

伯克氏菌E264（Burkholderia thailandensis E264）是从泰国稻田中分离得到的,能够合成组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）类抗癌物质Thailandepsin A。作为抗癌药物FK228的结构类似物,Thailandepsin A与FK228有不同的选择性抑制特点,尤其对皮肤T细胞淋巴瘤具显著抑制作用。尽管Thailandepsin A作为抗癌药物极具开发前景,但如何大量获取Thailandepsin A成为相关研究的瓶颈。目前,野生型菌株合成Thailandepsin A产量很低（10mg/L）,在对培养基和培养条件进行优化后有一定提高。本论文在此基础上,通过培养基优化的方法提高Thailandepsin A的产量,同时将发酵过程放大至5L发酵罐,通过动态吸附耦合装置与发酵过程偶联,解除产物抑制,实现连续吸附耦合发酵,从而提高Thailandepsin A的产量和生产效率。首先,通过摇瓶发酵方法,用单因素试验来进一步探索适合伯克氏菌E264菌株产Thailandepsin A的培养基成分,重点就不同种类和浓度的氨基酸前体、复合碳氮源、微量元素对Thailandepsin A产量的影响进行研究,得出结论:最适浓度的α-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸和甘氨酸复合添加至培养基中,Thailandepsin A的产量较对照提高65.9%;葡萄糖和甘油复合作为碳源能显著提高伯克氏菌E264生产Thailandepsin A的产量,最高能较对照提高54.48%（配比100%/20%）;胰蛋白胨和硫酸铵或氯化铵作为复合氮源,则不利于Thailandepsin A的高产;添加以下微量元素能提高Thailandepsin A产量:FeSO4·7H2O（最适添加浓度1mg/L）/ FeCl3（最适添加浓度1mg/L）、ZnSO4·7H2O（最适添加浓度2mg/L）、、MnCl2·4H2O（最适添加浓度0.1mg/L）。其次,初步探索了在发酵过程中补糖对Thailandepsin A产量的影响,通过设计累进补糖策略,使Thailandepsin A的产量最高达到205.29mg/L,是未补糖对照组的2.28倍,是最初培养基产量的20.5倍。从而找出其最适补糖分批发酵的条件,为后续的放大优化奠定了基础。再次,将伯克氏菌E264发酵生产Thailandepsin A的过程放大到5L发酵罐,通过摸索通气条件、树脂吸附、种源条件等条件,探索Thailandepsin A放大发酵的最优条件。在此基础上,设计和制作了外置式吸附耦合装置,使之与发酵罐形成吸附与发酵耦合的过程,从而实现伯克氏菌E264的连续发酵,同时配合不同的循环流速、开启时间、补糖策略的研究,以提高Thailandepsin A的产量。通过优化,伯克氏菌E264吸附耦合放大发酵生产Thailandepsin A的最优生产条件确定为:（1）接种量1%,种源为三级发酵种子;（2）搅拌转速:150rpm;通气量:1.3L/min;（3）罐压0.01MPa,发酵温度28℃;（4）耦合吸附装置,装置中内添加4%预处理后树脂,装置在发酵36h后开始不间歇运转,循环流速20ml/min;（5）从60h起,每12h流加1g/L的葡萄糖,直至发酵结束;（6）发酵终点采用经验方法,也即菌体不再生长后的24h停止。经验证,Thailandepsin A的产量能够达到224.11mg/L,是发酵罐优化前的5.6倍,是最初培养基产量的22.4倍。生产效率达到1.10 mg/L*h^-1,与发酵罐优化前相比大幅提高了65%,是最初培养基生产效率的6.6倍。通过以上研究,为伯克氏菌E264的进一步发酵研究和放大优化打下基础。

全文目录

摘要  6-9
ABSTRACT  9-16
第一章绪论  16-46
  1.1 HDACI 类抗癌药物  16-22
    1.1.1 癌症与抗癌药物  16-17
    1.1.2 组蛋白乙酰化酶（HAT）和去酰化酶（HDACs）  17-19
      1.1.2.1 组蛋白乙酰化酶（HAT）  18
      1.1.2.2 组蛋白去乙酰化酶（HDAC）  18-19
    1.1.3 HDACi 类抗癌药物  19-22
      1.1.3.1 HDACi 分类和应用现状  19-20
      1.1.3.2 HDACi 作用机制  20-22
  1.2 抗癌药物FK228  22-27
    1.2.1 FK228 简介  22
    1.2.2 FK228 的分子结构  22-23
    1.2.3 FK228 的作用机理  23
    1.2.4 FK228 的生物合成基因簇与合成途径  23-27
      1.2.4.1 NPRS-PKS-NPRS 装配线式生物合成途径  23-24
      1.2.4.2 FK228 的生物合成途径  24-27
    1.2.5 FK228 的药物前景  27
  1.3 FK228 类似物THAILANDEPSIN A  27-32
    1.3.1 伯克氏菌E264  27-28
    1.3.2 Thailandepsin A 及其抗癌活性  28-29
    1.3.3 Thailandepsin A 的生物合成途径  29-30
    1.3.4 Thailandepsin A 的发酵培养  30-32
  1.4 补料分批发酵（FED-BATCH FERMENTATION）  32-34
    1.4.1 补料分批发酵及其特点  32
    1.4.2 补料分批发酵的方式  32-33
    1.4.3 补料发酵的控制  33-34
  1.5 吸附耦合连续发酵  34-44
    1.5.1 生物发酵与分离耦合技术  34-36
    1.5.2 大孔树脂吸附耦合发酵  36-37
      1.5.2.1 吸附耦合发酵简介  36
      1.5.2.2 大孔树脂吸附  36-37
      1.5.2.3 三菱化学HP-20 大孔树脂  37
    1.5.3 连续发酵耦合装置  37-44
      1.5.3.1 外置式连续发酵耦合装置  38-42
      1.5.3.2 内置式连续发酵耦合装置  42-44
  1.6 本文研究的背景、内容和意义  44-46
第二章伯克氏菌E264 培养条件优化  46-77
  2.1 引言  46
  2.2 材料和方法  46-55
    2.2.1 实验材料  46-50
      2.2.1.1 菌株  46
      2.2.1.2 培养基  46-47
      2.2.1.3 实验所用主要试剂  47-49
      2.2.1.4 实验所用主要仪器与设备  49-50
    2.2.2 实验方法  50-55
      2.2.2.1 菌种培养方法  50
      2.2.2.2 树脂的预处理和添加  50
      2.2.2.3 Thailandepsin A 定量分析  50-51
      2.2.2.4 HPLC 标准曲线的测定  51
      2.2.2.5 菌体生物量的测定  51-53
      2.2.2.6 葡萄糖浓度的测定  53-54
      2.2.2.7 发酵液的处理及检测  54-55
      2.2.2.8 培养基成分的单因子实验  55
  2.3 结果和讨论  55-74
    2.3.1 添加不同氨基酸前体对Thailandepsin A 产量的影响  55-58
      2.3.1.1 添加单一氨基酸前体对Thailandepsin A 产量的影响  56-57
      2.3.1.2 添加复合氨基酸对Thailandepsin A 产量的影响  57-58
    2.3.2 不同配比复合碳源对Thailandepsin A 产量的影响  58-61
      2.3.2.1 葡萄糖和甘油复合碳源对Thailandepsin A 产量的影响  60-61
      2.3.2.2 葡萄糖和蔗糖复合碳源对Thailandepsin A 产量的影响  61
    2.3.3 不同配比复合氮源对Thailandepsin A 产量的影响  61-65
      2.3.3.1 胰蛋白胨和硫酸铵复合氮源对Thailandepsin A 产量的影响  63-64
      2.3.3.2 胰蛋白胨和氯化铵复合氮源对Thailandepsin A 产量的影响  64-65
    2.3.4 添加不同微量元素对Thailandepsin A 产量的影响  65-67
    2.3.5 不同补糖策略对Thailandepsin A 产量的影响  67-74
      2.3.5.1 不同累进补糖策略对Thailandepsin A 生产影响的初步探索  67-72
      2.3.5.2 第八组累进补糖策略的发酵动力学曲线测定  72-74
  2.4 小结和讨论  74-77
第三章伯克氏菌E264 连续吸附耦合放大发酵  77-115
  3.1 引言  77-78
  3.2 材料和方法  78-83
    3.2.1 实验材料  78-79
      3.2.1.1 菌株  78
      3.2.1.2 培养基  78-79
      3.2.1.3 实验所用主要试剂  79
      3.2.1.4 实验所用主要仪器与设备  79
    3.2.2 实验方法  79-83
      3.2.2.1 发酵罐扩大培养方法  79-80
      3.2.2.2 树脂的预处理和添加  80
      3.2.2.3 发酵液的处理及检测  80-81
      3.2.2.4 发酵罐氧传递系数KLa 值测定  81-83
  3.3 结果和讨论  83-112
    3.3.1 放大发酵条件初探  83-96
      3.3.1.1 不同通气条件对Thailandepsin A 生产效率的影响  83-89
      3.3.1.2 树脂原位吸附对Thailandepsin A 生产效率的影响  89-92
      3.3.1.3 不同种源条件对Thailandepsin A 生产效率的影响  92-96
    3.3.2 吸附耦合装置设计  96-100
      3.3.2.1 设计原则  96-97
      3.3.2.2 设计方案  97-99
      3.3.2.3 设计优点  99-100
    3.3.3 利用吸附耦合装置连续放大发酵  100-112
      3.3.3.1 不同循环流速下Thailandepsin A 连续吸附耦合发酵效率的比较  100-104
      3.3.3.2 不同吸附开始时间下Thailandepsin A 连续吸附耦合发酵效率的比较  104-108
      3.3.3.3 不同补糖策略下Thailandepsin A 连续吸附耦合发酵效率的比较  108-112
  3.4 小结和讨论  112-115
第四章总结及展望  115-118
  4.1 主要结论  115-116
  4.2 课题创新点  116
  4.3 研究展望  116-118
参考文献  118-127
致谢  127

伯克氏菌E264连续吸附耦合发酵生产Thailandepsin A的研究

内容摘要

全文目录

相似论文