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乳杆菌亚油酸异构酶转化沙棘共轭亚油酸工艺的研究

作　者: 孙琪
导　师: 王振宇
学　校: 东北林业大学
专　业: 食品科学
关键词: 乳杆菌沙棘籽油亚油酸异构酶固定化酶 CLA转化率
分类号: TQ645.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

我国沙棘资源丰富,占世界沙棘总种植面积的95%。沙棘中含有多种生物活性物质,营养丰富。大果沙棘籽油中含有大量的不饱和脂肪酸,其中亚油酸和亚麻酸的含量达80%以上。共轭亚油酸（CLA）是含有共轭双键的亚油酸（LA）各种异构体的总称,由于其令人瞩目的生理功效,已成为国内外研究的焦点。本实验从常见的乳杆菌入手,探索一条通过菌株筛选,亚油酸异构酶的分离纯化以及酶的固定化研究为主要线索的CLA生物合成的途径。本论文的主要实验结果如下:（1）乳杆菌菌种的筛选本文以乳化的沙棘籽油作为底物加入到试验所制备的复合乳杆菌中,利用乳杆菌所产生的亚油酸异构酶使亚油酸（LA）转化为共轭亚油酸（CLA）。但实验证明,筛选出CLA转化率高的菌株为MRS液体培养基培养的植物乳杆菌,植物乳杆菌发酵所产生的亚油酸异构酶酶活为13.82U,其CLA转化率为17.68%。本项研究为生物合成法生产大果沙棘籽油的共轭亚油酸提供了理论依据。（2）植物乳杆菌产酶条件的优化在单因素试验基础上选取试验因素与水平,根据中心组合（Box-Benhnken）试验设计原理采用四因素三水平的响应面分析法,依据回归分析确定各工艺条件的影响因子,以CLA转化率为响应值作响应面和等高线,并分析各个因素的显著性和交互作用。植物乳杆菌产亚油酸异构酶的最佳发酵条件为:发酵时间为30.21h、发酵温度为36.22℃、接种量为1.99%（v/v）、底物浓度为9.62%（v/v）。在最佳发酵条件下,实际CLA转化率为20.46%。（3）亚油酸异构酶的固定化条件优化及性质研究经过包埋载体的筛选,选择海藻酸钠-氯化钙包埋法固定化亚油酸异构酶,利用响应面法优化了固定化酶的制备条件,确定酶液添加量1.2mL、海藻酸钠浓度2.84%、胶凝时间6.42h、CaCl₂浓度3.77%。此条件下得固定化酶最佳CLA转化率的平均值为15.76%,达到了回归模型预测的理论转化率（16.53%）的95.34%。亚油酸异构酶经过固定化后,最适反应温度由30℃升至35℃;最适pH值由6.0升至6.5;热稳定性、酸碱稳定性和贮藏稳定性都得到显著的提高。固定化酶的动力学参数分别为Km=21.756μmol/L,Vmax=1.065μmol/h·mg。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 绪论  8-16
  1.1 引言  8-14
    1.1.1 亚油酸异构酶  8-9
    1.1.2 共轭亚油酸(CLA)  9-12
    1.1.3 固定化酶  12-14
  1.2 本研究的内容,目的及意义  14-16
    1.2.1 研究内容及方法  14
    1.2.2 研究目的及意义  14-16
2 共轭亚油酸高转化率的乳杆菌菌种的筛选  16-25
  2.1 试验材料及设备  16-17
    2.1.1 主要仪器设备  16
    2.1.2 主要试剂  16-17
    2.1.3 试验菌种  17
    2.1.4 培养基  17
  2.2 实验方法  17-20
    2.2.1 菌种的活化  17-18
    2.2.2 沙棘籽油乳浊液的制备(底物制备)  18-19
    2.2.3 产酶培养  19
    2.2.4 粗酶液的制备  19
    2.2.5 亚油酸异构酶酶活的测定  19
    2.2.6 共轭亚油酸的检测  19-20
  2.3 结果与分析  20-24
    2.3.1 共轭亚油酸(CLA)紫外吸收标准曲线  20
    2.3.2 测定结果及分析  20-24
  2.4 本章小结  24-25
3 植物乳杆菌产酶条件的优化  25-36
  3.1 材料与设备  25-26
    3.1.1 试验菌种  25
    3.1.2 主要培养基  25
    3.1.3 主要试剂  25-26
    3.1.4 主要实验仪器  26
  3.2 实验方法  26-29
    3.2.1 植物乳杆菌的活化与扩大培养  26
    3.2.2 菌体生物量的测定(湿细胞重法)  26
    3.2.3 底物沙棘籽油乳浊液的配制  26-27
    3.2.4 发酵条件的单因素试验  27
    3.2.5 响应面优化试验  27-28
    3.2.6 粗酶液制备  28-29
    3.2.7 亚油酸异构酶酶活的测定  29
    3.2.8 共轭亚油酸转化率的测定  29
  3.3 实验结果与分析  29-35
    3.3.1 单因素对CLA转化率的影响  29-31
    3.3.2 响应面优化试验  31-35
  3.4 本章小结  35-36
4 亚油酸异构酶的固定化条件优化及性质研究  36-54
  4.1 材料与设备  36-37
    4.1.1 主要仪器设备  36
    4.1.2 主要试剂  36-37
    4.1.3 菌种与培养基  37
  4.2 实验方法  37-40
    4.2.1 亚油酸异构酶的硫酸铵分级沉淀  37-38
    4.2.2 亚油酸异构酶酶活力的测定  38-39
    4.2.3 固定化方法和固定化载体的选择  39-40
  4.3 结果与分析  40-52
    4.3.1 蛋白质标准曲线的测定  40-41
    4.3.2 亚油酸异构酶的硫酸铵分级沉淀  41-42
    4.3.3 最佳载体的选择  42
    4.3.4 海藻酸钠包埋法条件的优化  42-45
    4.3.5 响应面优化试验  45-48
    4.3.6 固定化亚油酸异构酶的理化性质  48-52
  4.4 本章小结  52-54
结论  54-56
参考文献  56-62
攻读学位期间发表的学术论文  62-63
致谢  63-64

乳杆菌亚油酸异构酶转化沙棘共轭亚油酸工艺的研究

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