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人细胞色素P450氧化还原酶基因多态性对CYP3A4和CYP2B6代谢活性的影响

作　者: 陈璇
导　师: 陈枢青；那仁满都拉
学　校: 浙江大学
专　业: 药学
关键词: 细胞色素P450氧化还原酶 CYP3A4 CYP2B6 Bac-to-Bac(?) 昆虫细胞Sf9 代谢动力学基因多态性睾酮安非他酮
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

人NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(EC 1.6.2.4；NADPH-cytochrome P450 Oxidoreductase; POR)是定位在内质网膜上一个重要的黄素蛋白,它是唯一的传递电子给人细胞色素P450(Cytochrome P450, CYP)酶系并帮助其完成对底物氧化功能的辅酶。POR整体敲除对小鼠具有早期胚胎致死性,而POR肝部定点敲除的小鼠在形态和生殖上都是正常的,但其药物代谢的能力大大下降。POR能够还原一系列内／外源性的电子受体,包括：细胞色素C,铁氰化钾和2,6一二氯靛酚。它还能够直接代谢活化一些重要的药物,如丝裂霉素C,环磷酰胺和苯三嗪SR4233,以及环境毒物,如百草枯。编码人POR的基因具有较强的基因多态性。自2004年六个POR的错义突变体(Y181D、A287P、R457H、V492E、C569Y和V608F)首次被报道以来,到目前为止已有超过40个不同的POR错义突变体被报道。这些报道对于POR的错义突变体的功能研究主要集中于其对一系列激素代谢紊乱相关疾病的发生的影响上,然而关于其在药物代谢中的作用却鲜有涉及。重组药物代谢酶是药物体外代谢研究的一项重要工具,可以为体内代谢得到的结果提供一些解释和依据或者用来预测体内代谢的情况。通过体外重组表达某个酶的多种突变体,并对它们催化代谢某种药物的能力进行评价比较,所得结果可以为药物基因组学研究提供一定的参考信息。本实验采用Bac-to-BacTM杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了活性较好的POR野生型及已报道的6种POR错义突变型蛋白(K49N、A115V、Y181D、S244C、A287P、G413S),首先,考察了POR错义突变体在直接还原底物细胞色素C时产生的活性差异；继而进一步系统地考察了这6种POR错义突变体在参与CYP3A4和CYP2B6介导的代谢反应中所产生的影响,具体三部分的实验如下所述：1野生型POR及其突变株的构建及表达目前几乎在所有报道的关于POR突变体活性影响的研究中使用的都是原核表达系统,得到的通常都是氨基端缺少了一段含有27个氨基酸的疏水性序列的重组POR蛋白,在本实验中,我们采用Bac-to-BacTM杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了含有全长序列的POR野生型及突变型蛋白。本实验以含有POR野生型基因的pFastBacTM 1重组质粒为模板,通过PCR在基因的两侧加入BamH I和Xho I的酶切位点,同时在POR野生型基因终止密码子前加入6个组氨酸密码子,以便用his-tag抗体进行western blot鉴定,然后通过定点突变技术获得POR突变体的DNA序列。经测序验证后,选取序列正确的PORs与pFastBacTM质粒连接,构建PFastBacTM1-PORs重组质粒。重组pFastBacTM1-PORs转化MAX Efficiency DH10BacTM competent Escherichia coli后,在DH10Bac中发生转座,获得Bacmid-PORs重组粘粒。用此重组粘粒转染Sf9细胞,即可获得第一代重组杆状病毒。通过将病毒反复感染细胞以获得较高滴度的P3代病毒后,用real-timePCR对病毒滴度进行定量并优化好表达条件后,即可获得活性较好的重组POR野生型和各突变型蛋白。实验过程中还平行构建和表达了野生型的CYP3A4和CYP2B6蛋白,并通过CO差示光谱的方法对其含量进行了测定。随后以细胞色素C为底物,在NADPH系统中对POR野生型以及其突变体进行活性测定,实验结果显示,POR突变体A115V、Y181D、A287P对细胞色素C的还原活性有显著下降,活性分别为野生型的69%、13%和21%；而突变体G413S对细胞色素C的还原活性则明显高出野生型约77%；POR突变体(K49N和S244C)的活性则与野生型相近分别为野生型的85%和113%。该部分实验初步证明：POR的基因多态性在一定程度上对其直接代谢某些化合物是有所影响,并且不同的错义突变体影响的程度可能不同。2 POR基因多态性对CYP3A4代谢活性的影响本部分实验选择了CYP450中含量最高的CYP3A4亚家族作为模型和参考对象,进一步通过Bac-to-BacTM系统共表达了CYP3A4和POR野生型及其突变体,继而选用CYP3A4活性鉴定的探针底物睾酮,在体外对CYP3A4-PORs的代谢活性差异进行了评价,以检测POR的基因多态性对CYP3A4代谢活性的影响。本章实验中,Y181D和A287P这两个POR的突变体被发现几乎完全抑制了CYP3A4对底物睾酮的代谢能力,在20μmol/L～400μmol/L的底物浓度范围内,无任何代谢产物生成,这与上一章在细胞色素C活性测试中所的到的结果相一致；其次,CYP3A4-K49N和CYP3A4-A115V的Km值和Vmax值与CYP3A4-WT的Km值和Vmax值相比,均具有显著性差异,因而其CLint (Vmax/Km)也明显比CYP3A4-WT高出-35%；突变体G413S在细胞色素C还原活性测试中表现出高于野生型约77%的还原活性,与此一致的是,G413S在对CYP3A4介导的代谢活性研究中,也表现出较高的代谢活性,就综合代谢能力CLint来看,其活性明显高出CYP3A4-WT大约65%。该部分实验结果进一步提示,POR的基因多态性在一定程度上是会影响CYP450的代谢活性,POR代谢功能的紊乱,必将会对CYP450的药物代谢能力造成严重的影响,并且不同的错义突变体影响的程度可能不同,而这些不同仅从POR突变体对其直接底物代谢的影响程度是无法准确地预测其在其他类型底物及CYP酶介导的代谢过程中的作用情况。3 POR基因多态性对CYP2B6代谢活性的影响本部分实验选择了CYP450中含量较低但是却担当了人体内许多重要药物代谢功能的CYP2B6为另一个考察对象,进一步通过Bac-to-BacTM系统共表达了CYP2B6和POR野生型以及突变体,然后选用CYP2B6活性鉴定的探针底物安非他酮,通过体外实验对CYP2B6-PORs的代谢活性差异进行了评价,以检测POR的基因多态性对CYP2B6代谢活性的影响。在上一章中,Y181D和A287P这两个突变体几乎完全抑制了CYP3A4对底物睾酮的代谢能力,而本章实验结果显示,CYP2B6-Y181D和CYP2B6-287P这两个突变体与CYP2B6-WT相比,虽然其Km具有显著性的差异,但是由于其Fmax也发生了同等幅度的变化,因而通过CLint综合来看,其活性变化降低为野生型的70%。同时,在上一章中,CYP3A4-K49N对睾酮的代谢活性比CYP3A4-WT明显高出31%；然而,在本章中,CYP2B6-K49N对安非他酮的代谢活性仅为野生型的74%,具有显著性差异。最后,A115V和G413S在支持CYP3A4对睾酮的代谢时,其代谢活性分别高出野生型36%和65%。而在CYP2B6代谢活性测试实验中,CYP2B6-A115V和CYP2B6-G413S对安非他酮的代谢活性与野生型类似。结合上一部分,本实验的结果提示,POR的错义突变体对不同的CYP酶介导的底物代谢活化的影响可能有所不同,且很难仅从POR突变体支持一种CYP酶介导的某一个底物的催化反应中的情况来推测其对其他所有的CYP酶及底物的支持能力。在将来的研究当中可以进一步利用本实验中建立的方法对更多的CYP酶及底物进行研究,也可用同样的体系对CYP酶系的基因多态性功能进行研究。本课题得到的实验结果提示POR的基因多态性在个体中,对CYP3A4和CYP2B6的药物代谢能力的影响是具有显著性差异的,我们既不能仅从POR突变体对其直接底物代谢的影响程度,来准确预测其在其他类型底物及CYP酶介导的代谢过程中的作用情况,也不能仅从POR突变体支持一种CYP酶介导的某一个底物的催化反应中的情况来推测其对其他所有的CYP酶及底物的支持能力。因此,POR应该作为药物基因组学研究中又一个新的靶点,并可作为指导相关药物个体化给药以及调查人群对某些药物的疗效和毒副性差异的生物标记物,特别针对某些会对CYPs酶的代谢活性造成严重性影响的POR突变体,我们应该在临床用药时,给予特别的关注。本课题的研究为进一步建立起一个完整的应用于临床的POR基因多态性的功能数据库奠定了坚实的基础。

人细胞色素P450氧化还原酶基因多态性对CYP3A4和CYP2B6代谢活性的影响

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