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二化螟对Cry1Ab抗性风险评估和Cry1A毒素与二化螟中肠BBMV配基结合分析

作　者: 徐永桂
导　师: 吴益东
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 二化螟 Cry1A毒素 抗性风险评估 配基印迹 氨肽酶N
分类号: S435.112.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


二化螟Chilo suppressalis（Walker）是严重威胁我国水稻生产的重要害虫之一。近年来,受耕作制度和种植结构的变化、高产优质水稻品种的大面积种植、气候等原因的影响,二化螟的发生逐年加重,并且由于化学农药的长期大量使用,二化螟的抗药性呈明显上升趋势,给防治工作来了困难。转Bt CryAb基因水稻的出现为防治二化螟提供了一种新的有效方法,但是从生物学和进化角度来看,二化螟对转Bt基因水稻也可以产生抗性是一种胁迫进化现象。因此,研究Bt毒素对二化螟的杀虫机理及二化螟对Bt产生抗性的可能机制,将为制定转基因水稻的抗性治理策略、延长转基因水稻的使用寿命等提供重要的理论依据。本文建立了3种CrylA毒素对二化螟的敏感毒力基线,评估了二化螟及对Cry1Ab的抗性风险,利用配基印迹法研究了Cry1A毒素同二化螟中肠BBMV受体蛋白的结合谱,并通过RT-PCR获得了4个APN基因的cDNA片段。1.二化螟对Cry1Ab的抗性筛选及抗性风险评估用毒蛋白涂表法测定了2002年采自浙江苍南的二化螟室内品系对Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac活化毒蛋白的敏感性水平,建立了3种毒素对二化螟的敏感毒力基线。结果表明,Cry1Ab对该品系的毒力最高(LC50为0.14μg/cm2),其次是Cry1Ac(LC50为0.37)和Cry1Aa(LC50为0.49μg/cm2)。用Cry1Ab对2006年采自江苏句容、安徽合肥和宣城、浙江杭州的田间二化螟混合种群（JAZ）进行12代的抗性筛选,其对Cry1Ab的敏感性下降了3.3倍。平均抗性现实遗传力h2为0.068,表明抗性风险较低。根据平均抗性现实遗传力、毒力回归线平均斜率进行估算,在50%-95%的选择压力下,二化螟对Cry1Ab的抗性上升10倍需要26至8代。2.二化螟中肠受体与Cry1A毒素结合分析配基结合分析结果表明二化螟CN品系幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）中有6个Cry1Ac结合蛋白（分子量分别为180,160,120,90,70和50 kDa）,其中180、160和90 kDa结合蛋白的条带明显深于其他结合蛋白的条带,表明这3个受体蛋白结合浓度较高。同源竞争结合结果表明,180和90 kDa结合蛋白为Cry1Ac的低亲合性结合蛋白,其他4个为高亲合性结合蛋白。为了研究Cry1Ac和Cry1Ab受体结合部位的交叉反应,本文还进行了异源竞争结合研究。研究结果表明,Cry1Ab可以与Cry1Ac所有的6个结合蛋白进行竞争性结合,其中与180、120、70和50 kDa结合蛋白具有高亲合性,而与160和90 kDa结合蛋白具有低亲合性.上述结果表明,Cry1Ac与Cry1Ab在二化螟幼虫中肠BBMV上具有多个共享的结合位点,但对每个结合位点的亲合力有差异。基于毒素结合部位的相似性,Cry1Ac和Cry1Ab不宜同时用于转基因Bt水稻来控制二化螟。进一步分离、鉴定二化螟幼虫中肠BBMV中Cry1A毒素的受体蛋白将有助于研究Cry1A毒素的作用机理和二化螟对Cry1A毒素的抗性机理。3.二化螟中肠APN类受体基因片段cDNA的克隆氨肽酶N（aminopeptidase N,APN）受体是昆虫体内Bt毒素的重要作用靶标。本研究利用简并引物,从二化螟中肠中获得4个不同的APN类受体基因cDNA片段。该片段长约600bp,编码约200个氨基酸残基,分别命名为CsAPN1、CsAPN2、CsAPN3和CsAPN4。CsAPN1同家蚕APN（GenBank No.:BAA32140）氨基酸序列相似性高达73%,CsAPN2同二化螟APN（GenBank No.:ABC69855）的相似性高达100%,CsAPN3同棉铃虫APN2（GenBank No.:AAP37951）相似性为68%,CsAPN4同欧洲玉米螟APN3（GenBank No.:ABL01483）相似性为77%。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 文献综述  12-37
  二化螟  12-18
    1 分布与危害  12
    2 发生情况  12
    3 发生原因分析  12-13
      3.1 气候变化  12-13
      3.2 耕作栽培制度与水稻品种的变化  13
      3.3 天敌控制作用的减弱  13
      3.4 抗药性的发展  13
    4 抗药性现状  13-14
      4.1 敏感期  13-14
      4.2 抗性发展期  14
      4.3 多种抗性发展期  14
    5 抗药性产生的机制  14-18
      5.1 表皮穿透  14-15
      5.2 解毒酶的代谢及结合作用增强  15-16
        5.2.1 多功能氧化酶系  15
        5.2.2 酯酶  15-16
        5.2.3 谷胱甘肽-S-转移酶  16
        5.2.4 DDT-脱氯化氢酶  16
      5.3 靶标敏感性下降  16-17
        5.3.1 γ-氨基丁酸门控氯离子通道  16
        5.3.2 钠离子通道  16-17
        5.3.3 烟碱型乙酰胆碱  17
        5.3.4 乙酰胆碱酯酶  17
      5.4 蛋白质的结合作用  17-18
  转基因植物  18-25
    1 转基因的方法  18-19
      1.1 基因枪法  18
      1.2 PEG诱导法  18
      1.3 电击法  18
      1.4 花粉管通道法  18-19
      1.5 农杆菌介导的基因转化法  19
      1.6 其他方法  19
    2 Bt转Bt基因作物  19-21
      2.1 转Bt基因烟草  19
      2.2 转Bt基因棉花7  19-20
      2.3 转Bt基因马铃薯  20
      2.4 转Bt基因豆类作物  20
      2.5 转Bt基因花生  20
      2.6 转Bt基因玉米  20
      2.7 转Bt基因高粱  20
      2.8 转Bt基因水稻  20-21
    3 转基因作物的生态风险  21-24
      3.1 转基因作物基因漂流导致的杂草化问题  22
        3.1.1 转基因作物本身"杂草化"  22
        3.1.2 转基因作物通过"基因漂移"使杂草成为"超级杂草"  22
      3.2 转基因作物抗虫作物的潜在风险  22
      3.3 转基因作物对非靶标生物和生物多样性的影响  22-24
        3.3.1 对非靶标生物的影响  22-23
        3.3.2 对生态系统多样性的影响  23-24
      3.4 转基因作物的食品安全性分析  24
    4 保障转基因作物的生态安全性措施  24-25
      4.1 加强对转基因作物的安全性评价  25
      4.2 采用生殖隔离,阻断转基因花粉的漂移  25
      4.3 转基因遗传调控  25
      4.4 推广时种植一定比例的非转基因同类作物  25
  苏云金菌芽孢杆菌  25-37
    1 Bt的发现和历史  25-26
    2 Bt基因的分类与命名  26-27
      2.1 Hofte分类法  26-27
      2.2 Crickmore分类法(Crickmore et al.,1998)  27
      2.3 其它分类方法  27
    3 Bt晶体蛋白的结构功能关系  27-28
    4 Bt的杀虫机理  28-29
    5 Bt毒素的结合受体  29-33
      5.1 受体与Bt毒素的结合动力学  29-30
      5.2 钙粘蛋白(Cadherin-like protein,CAD)  30-31
        5.2.1 类钙粘蛋白的结构特征  30
        5.2.2 类钙粘蛋白与毒素的结合特性  30-31
      5.3 GPI锚定蛋白(GPI-anchored protein)  31-32
        5.3.1 氨肽酶  31-32
        5.3.2 碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatese,ALP)  32
      5.4 其他类型受体  32-33
    6 Bt的抗性机理  33-35
      6.1 昆虫体内可能对Bt产生抗性的环节  33
      6.2 三种主要的抗性机理  33-35
        6.2.1 蛋白酶水解发生变化  33-34
        6.2.2 中肠受体的变异  34-35
        6.2.3 中肠上皮的缺失修复作用  35
    7 Bt的抗性遗传方式及抗性风险评估  35-37
      7.1 Bt的抗性遗传方式  35
      7.2 Bt抗性风险评估  35-37
第二章 二化螟对Cry1Ab抗性筛选及抗性风险评估  37-44
  1 材料与方法  38-40
    1.1 试验材料  38-39
      1.1.1 供试昆虫及其饲养  38
      1.1.2 供试药剂  38
      1.1.3 试验器材  38
      1.1.4 二化螟人工饲料  38-39
    1.2 生物测定方法(毒素涂表法)  39
    1.3 二化螟对Cry1A毒素敏感毒力基线的建立  39
    1.4 抗性品系的筛选  39
    1.5 抗性现实遗传力  39
    1.6 抗性预测  39-40
    1.7 数据分析  40
  2 结果与分析  40-42
    2.1 敏感毒力基线的建立  40
    2.2 抗性筛选  40
    2.3 二化螟对Cry1Ab抗性现实遗传力  40-42
  3 讨论  42-44
第三章 二化螟中肠受体与Cry1A毒素结合分析  44-54
  1 材料和方法  45-48
    1.1 试验材料  45
      1.1.1 供试昆虫  45
      1.1.2 主要试剂  45
      1.1.3 主要仪器  45
    1.2 试验方法  45-48
      1.2.1 二化螟中肠BBMV的制备  46
      1.2.2 SDS-PAGE电泳检测  46-47
      1.2.3 Cry1A毒素生物素(biotin)标记  47
      1.2.4 Cry1A毒素与受体的配基结合  47-48
      1.2.5 Cry1A毒素竞争结合  48
      1.2.6 蛋白质含量测定  48
  2 结果与分析  48-51
    2.1 SDS-PAGE电泳结果  48-49
    2.2 Cry1A毒素与二化螟中肠BBMV配基结合  49-50
    2.3 二化螟中肠BBMV与Cry1Ab毒素的同源竞争结合  50
    2.4 二化螟中肠BBMV与Cry1Ac毒素的竞争结合  50-51
  3 讨论  51-54
第四章 二化螟中肠APN类受体基因片段克隆  54-67
  1 材料和方法  55-56
    1.1 材料和试剂  55
    1.2 细菌培养基  55
    1.3 琼脂糖凝胶电泳缓冲液  55
    1.4 主要试剂  55-56
    1.5 仪器设备  56
  2 试验方法  56-60
    2.1 RNA的提取(SV Total Isotation system)  56
    2.2 Invitrogen:M-MLV反转录  56-57
    2.3 cDNA模板质量检测  57
    2.4 兼并引物扩增  57-58
    2.5 PCR产物的回收与纯化  58
    2.6 PCR纯化产物与质粒载体的连接  58
    2.7 转化  58-59
    2.8 细菌的扩大培养  59
    2.9 质粒DNA的提取  59-60
    2.10 酶切反应  60
    2.11 目标片段检测  60
    2.12 序列分析与系统发育树的构建  60
  3 结果与分析  60-66
    3.1 检测cDNA模板  60-61
    3.2 兼并引物扩增结果  61
    3.3 二化螟氨肽酶受体基因的cDNA片段的克隆与序列分析  61-64
    3.4 二化螟APN基因的系统进化分析  64-66
  4 讨论  66-67
全文总结  67-68
参考文献  68-87
附录:发表的学术论文  87-88
致谢  88

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 虫害 > 水稻螟虫
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