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茶氨酸生物合成：基因工程菌构建及其诱导合成条件

作　者: 朱文娴
导　师: 成浩
学　校: 南京农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶氨酸 γ-谷氨酰转肽酶 谷氨酰胺合成酶 工程菌 催化合成
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


茶氨酸（Theanine）不仅是茶叶中的特征氨基酸,而且是茶汤特殊风味和鲜爽味的主要成分,是评价高级绿茶的重要标志。同时,大量研究和临床试验表明茶氨酸具有促进大脑功能和神经的生长、抗肿瘤、降压安神等功效。居于以上特点,其制备研究在目前的茶学研究中逐渐成为一个热点。由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸,成本较高;化学合成茶氨酸工艺较复杂;组织培养合成茶氨酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文将生物技术运用到天然产物制备技术中,开展了工程菌构建方面工作。本论文通过基因克隆技术构建了工程菌,优化了工程菌催化合成茶氨酸的条件,从而达到提高茶氨酸产量的目的。主要研究结果如下:1、以培养好的Escherichia coli DH5α（E.coli DH5α）菌液为模板进行PCR反应,将扩增出的γ-谷氨酰转肽酶基因片断和载体pUC19,相连接构建重组质粒pUC19-GGT,将重组质粒pUC19-GGT转化至E.coli DH5α中,构建工程菌。工程菌株经0.1 mM IPTG在32℃诱导后,经酶活性检测,工程菌株每克湿菌体的酶活达到0.236 U/mL左右,约是出发菌株E.coli DH5α的2.6倍。工程菌经32℃培养6 h左右,然后再加IPTG至0.1mM于32℃诱导表达4 h收集菌体。1mL反应体系（含0.35ML-谷氨酰胺、2.0 M盐酸乙胺、70 mg/mL菌体、pH 9.5）于30℃培养4h,茶氨酸的最大生成量为0.475g/L左右。2、以培养好的荧光假单胞的菌液为模板进行PCR反应,将扩增出的谷氨酰胺合成酶基因片断和载体pET32a,相连接构建重组质粒pET-GS,将重组质粒pET-GS转化至E.coli BL21中,构建工程菌。工程菌株经0.1 mM IPTG在28℃诱导后,经酶活性检测,工程菌株湿菌体的酶活达到41.70 U/mgprot左右,约是出发菌株E.coli BL21的126.5倍。3、本实验优化了工程菌pET-GS催化合成茶氨酸的反应条件,工程菌经32℃培养6 h左右,然后再加IPTG至0.1mM于28℃诱导表达4h收集菌体。1 mL反应体系（L-谷氨酸钠0.2 M,盐酸乙胺1.2 M,咪唑100 mM,MnCl25 mM,ATP 30 mM,菌体100 mg/mL,pH 9.5）,200 rpm,于30℃培养14 h,茶氨酸的最大生成量为6.2 g/L左右。

全文目录


英文缩略表  9-10
摘要  10-11
ABSTRACT  11-13
第一章 绪论  13-20
  1.1 茶氨酸  13-16
    1.1.1 茶氨酸研究的历史与现状  13-14
    1.1.2 茶氨酸的制备  14-16
    1.1.3 茶氨酸分析测定及提取纯化  16
    1.1.4 茶氨酸的发展前景  16
  1.2 γ-谷氨酰转肽酶  16-18
    1.2.1 γ-谷氨酰转肽酶的分布  16-17
    1.2.2 γ-谷氨酰转肽酶的制备  17
    1.2.3 γ-谷氨酰转肽酶的催化反应  17
    1.2.4 γ-谷氨酰转肽酶活性的测定  17-18
    1.2.5 γ-谷氨酰转肽酶的应用及发展前景  18
  1.3 谷氨酰胺合成酶  18-20
    1.3.1 谷氨酰胺合成酶的分布  18-19
    1.3.2 谷氨酰胺合成酶的催化反应  19
    1.3.3 谷氨酰胺合成酶的应用价值  19-20
第二章 实验设计方案  20-23
  2.1 实验目的  20
  2.2 实验主要内容  20
  2.3 技术路线  20-23
    2.3.1 γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆与表达  20-21
    2.3.2 谷氨酰胺合成酶基因的克隆与表达  21-22
    2.3.3 工程菌pET-GS催化合成茶氨酸反应条件的优化  22-23
第三章 大肠杆菌DH5A中的谷氨酰转肽酶基因的克隆  23-36
  3.1 材料与方法  23-26
  3.2 实验方法  26-30
    3.2.1 引物的设计与合成  26
    3.2.2 以菌液为模板进行PCR扩增  26-27
    3.2.3 PCR产物的回收  27
    3.2.4 目的片段和载体双酶切并进行产物回收及纯化  27-28
    3.2.5 连接反应  28
    3.2.6 DH5a感受态细胞的制备  28-29
    3.2.7 连接产物转化感受态细胞  29
    3.2.8 碱法小批量抽提质粒DNA[46]  29-30
    3.2.9 核酸电泳  30
    3.2.10 重组质粒pUG-GGT的双酶切验证  30
    3.2.11 基因序列测定  30
  3.3 结果与分析  30-35
    3.3.1 谷氨酰转肽酶基因的PCR扩增  30-31
    3.3.2 重组质粒pUC19-GGT的构建  31-32
    3.3.3 重组质粒pUC19-GGT双酶切验证  32
    3.3.4 序列测定  32-35
  3.4 小结  35-36
第四章 Γ-谷氨酰转肽酶的诱导表达研究  36-43
  4.1 材料和试剂  36
  4.2 实验方法  36-38
    4.2.1 工程菌生长曲线制作方法  36-37
    4.2.2 不同诱导温度优化  37
    4.2.3 不同养菌温度优化  37
    4.2.4 不同诱导剂浓度优化  37-38
    4.2.5 酶活检测  38
    4.2.6 茶氨酸合成测定  38
  4.3 结果与分析  38-41
    4.3.1 工程菌生长曲线的制作  38-39
    4.3.2 诱导温度优化结果  39
    4.3.3 养菌温度优化结果  39-40
    4.3.4 诱导剂浓度优化结果  40
    4.3.5 酶活测定  40
    4.3.6 茶氨酸合成测定  40-41
  4.4 小结  41-43
第五章 荧光假单胞菌中的谷氨酰胺合成酶基因的克隆  43-53
  5.1 材料与方法  43
  5.2 实验方法  43-47
    5.2.1 溶菌酶法抽提基因组  43-44
    5.2.2 引物的设计与合成  44
    5.2.3 以菌液为摸板进行PCR扩增及产物回收  44-45
    5.2.4 目的片断和载体双酶切  45
    5.2.5 连接反应  45-46
    5.2.6 BL21感受态细胞的制备  46
    5.2.7 连接产物转化感受态细胞  46
    5.2.8 重组质粒pET-GS的双酶切验证  46
    5.2.9 重组质粒pET-GS的PCR验证  46-47
    5.2.10 基因序列测定  47
  5.3 结果与分析  47-52
    5.3.1 荧光假单胞菌基因组的抽提  47
    5.3.2 谷氨酰胺合成酶基因的PCR扩增  47-48
    5.3.3 重组质粒pET-GS的构建  48
    5.3.4 重组质粒pET-GS的双酶切验证  48-49
    5.3.5 基因序列测定  49-52
  5.4 小结  52-53
第六章 谷氨酰胺合成酶的诱导表达研究  53-60
  6.1 材料和试剂  53-54
  6.2 实验方法  54-56
    6.2.1 工程菌生长曲线制作方法  54
    6.2.2 表达产物SDS-PAGE分析  54
    6.2.3 GS试剂盒测定GS转移酶活性  54-55
    6.2.4 不同诱导剂浓度优化  55
    6.2.5 不同养菌温度优化  55
    6.2.6 不同诱导温度优化  55
    6.2.7 酶活性检测  55-56
  6.3 结果与分析  56-59
    6.3.1 工程菌生长曲线制作  56
    6.3.2 表达产物SDS-PAGE分析结果  56-57
    6.3.3 不同诱导剂浓度优化结果  57-58
    6.3.4 不同养菌温度优化实验结果  58
    6.3.5 不同诱导温度优化实验结果  58-59
    6.3.6 酶活性检测  59
  6.4 小结  59-60
第七章 工程菌催化合成茶氨酸反应条件的优化  60-66
  7.1 材料和试剂  60
  7.2 实验方法  60-61
    7.2.1 茶氨酸合成测定  60
    7.2.2 pH对茶氨酸合成的影响  60
    7.2.3 ATP浓度对茶氨酸合成的影响  60-61
    7.2.4 缓冲液对茶氨酸合成的影响  61
    7.2.5 底物浓度对茶氨酸合成的影响  61
    7.2.6 反应时间对茶氨酸合成的影响  61
    7.2.7 对照实验  61
  7.3 实验结果  61-65
    7.3.1 pH对茶氨酸合成的影响  61-62
    7.3.2 ATP浓度对合成茶氨酸的影响  62
    7.3.3 咪唑作为缓冲液的确定  62-63
    7.3.4 底物浓度对合成茶氨酸的影响  63-64
    7.3.5 反应时间对合成茶氨酸的影响  64-65
  7.4 小结  65-66
第八章 讨论与总结  66-68
参考文献  68-72
致谢  72-73
攻读硕士学位期间发表论文情况  73

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 饮料作物 > 茶
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