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NMDA受体(NMDAR)是哺乳类中枢神经系统中重要的离子型谷氨酸受体,激活后能介导突触后神经元的去极化及胞内钙离子的瞬态增加,这决定了NMDA受体在生理及病理情况下均具有重要作用。在生理状态下,NMDA受体对大脑学习记忆功能的正常运行至关重要,当突触后NMDA受体被激活时,钙离子通过NMDA受体进入胞内,触发活动依赖的突触传递效能改变,如长时程增强(LTP,long-term potentiation)和长时程减弱(LTD,long-term depression);在病理状态下,当NMDA受体被过度激活时,它能够导致细胞死亡,例如脑组织缺血时,ATP供给匮乏,细胞内外离子梯度丧失,兴奋性神经递质谷氨酸大量释放,NMDA受体被过度激活,大量的钙离子进入神经元胞内,胞内钙超载引起下游蛋白激酶、蛋白酶激活,最终半胱天氡酶激活引起细胞凋亡。因此研究生理及病理条件下NMDA受体活性及转运的分子调控机制具有重要意义。1.甘氨酸通过NMDA受体双向调节病理性缺血后损伤长时程突触传递效能的改变,例如LTP,被认为是大脑学习记忆的分子机制。在体外给予脑片短时间缺氧缺糖(Oxygen and glucose deprivation,OGD)处理能够诱导病理性缺血后长时程增强(post-ischemic LTP,i-LTP),这个诱导过程同样需要NMDA受体激活开放,钙离子进入胞内。因此认为LTP和脑缺血存在一定的联系,研究OGD诱导的LTP分子机制能够为阐明脑缺血发病机理以及临床治疗脑中风提供必要的实验基础。局部缺血能够引起短时间内甘氨酸等在内的多种氨基酸释放的增加。甘氨酸有双重作用,一方面它是NMDA受体的共激动剂,结合NMDA受体上的共激活位点(site B),发挥兴奋性作用;另一方面它是中枢神经系统中一类主要的抑制性神经递质,激活甘氨酸受体(site A),发挥抑制性作用。先前有很多的研究是关于甘氨酸在缺血性脑损伤过程中的作用,但是究竟甘氨酸对脑缺血是损害作用还是保护作用还存在很大争议,并且其中的分子机制还不清楚。本实验采用脑片灌流OGD人工脑脊液的方法构建离体细胞缺血模型,用全细胞膜片钳方法记录CA1区锥体神经元兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSC),短时间给予OGD后,能诱导病理性i-LTP,在灌流OGD的同时给予不同浓度的甘氨酸,观察其对i-LTP的影响;同时也采用构建在体脑缺血模型的方法,在体闭塞大脑中动脉(MCAO),再灌注后,分别腹腔注射不同浓度的甘氨酸,观察脑梗死灶的变化情况。实验结果表明,甘氨酸对i-LTP具有浓度依赖的双向作用。外源性给予低浓度的甘氨酸能够增加i-LTP的幅度,并且在体实验能够进一步增大缺血梗死区,这提示低浓度的甘氨酸具有神经损害作用;而给予高浓度甘氨酸可以抑制i-LTP,并且能够减小缺血梗死区,这提示高浓度甘氨酸具有神经保护的作用。另外我们通过灌流不同浓度的甘氨酸转运体拮抗剂,造成不同浓度内源性甘氨酸的蓄积,同样能观察到类似的双向作用的现象。进一步发现,低浓度甘氨酸的损害作用是通过结合NMDA受体的共激动位点(site B)实现的;而高浓度甘氨酸的保护作用则是通过激活甘氨酸受体(site A),继而调节NMDA受体亚单位组成实现的。结果提示甘氨酸对脑缺血具有双重作用,即低浓度具有损害作用,而高浓度具有保护作用,甘氨酸受体有可能成为临床治疗脑中风的新靶点。2. MyosinⅡ参与调控LTP过程中NMDA受体转运在神经系统中,LTP和LTD反映突触传递效能的持久变化,是研究学习记忆机制的重要模型。而谷氨酸受体在LTP和LTD的诱发和维持过程中起关键性作用。在LTP过程中,突触反应的增强主要依靠突触后AMPA受体(AMPAR)的功能,受体数量以及亚单位组成的改变。近几年对于AMPA受体的上膜研究较多,最近发现在LTP中马达蛋白Myosin Vb或Myosin Va直接转运含AMPA受体的循环内吞体从树突棘基底部到达顶部。NMDA受体也是中枢神经系统中重要的兴奋性谷氨酸受体,它在兴奋性突触功能中起着关键的“分子开关”的作用,多种形式的突触可塑性的诱导都需要NMDA受体的激活以及随后胞内Ca2+浓度的增加。突触中NMDA受体的数量不是固定不变的。PMA激活PKC诱导化学性LTP及电刺激诱导LTP也都能引起NMDA受体介导的LTP,其重要机制是NMDA受体的插入、突触后NMDA受体数量的增多以及亚基构成的变化。那么NMDA受体是如何转运到突触后膜的,这个过程又是怎样被调节的?为了阐明这些问题,我们在海马CA1区锥体细胞上用PMA诱导化学性LTP作为实验模型,应用全细胞膜片钳技术,将细胞膜电位钳制在+40 mV记录NMDA受体介导的EPSCs。另外也采用免疫荧光染色,免疫印迹,免疫共沉淀,结合小分子肽干扰技术,研究LTP过程中,NMDA受体转运至突触后膜的调节机制。我们的实验结果发现,PMA诱导能使突触后膜NMDA受体表达增加,同时myosin IIB在突触后致密部位(postsynaptic density, PSD)中的量也增加,两者的结合也增加。我们用Tat-NR1短肽干扰NMDA受体和myosin II的结合,发现在PSD部位两者的量和结合都减少。结果提示,PKC诱导的NMDA受体转运至突触后膜,需要myosin IIB的活性以及myosin IIB与NMDA受体的相互作用,myosin IIB很可能是LTP过程中参与调节NMDA受体转运上膜的重要信号分子。
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