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基因转染的虹膜色素上皮细胞治疗RCS大鼠视网膜色素变性的实验研究

作　者: 张英瑜
导　师: 杨丽霞；高朋芬
学　校: 福建医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 脑源性神经营养因子 虹膜色素上皮细胞 视网膜色素变性 酶联免疫吸附法 视网膜电图 感光细胞 凋亡 免疫组化
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


遗传性视网膜变性是一组以进行性光感受器细胞及色素上皮细胞功能丧失为共同表现的疾病。目前为止,这些疾病尚无有效治疗方法[1, 2]。全世界有数百万人因此永久致盲,危害性极大。临床上迫切需要有效措施以改善和维护RPE功能,防止感光细胞变性及凋亡,这是多年来全世界范围内一大热点和难点。目前发现脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)能促进培养的人和牛的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞分化,通过自分泌或通过胶质细胞调节视网膜变性中感光细胞的生存,使视网膜细胞存活[3, 4, 5]。本研究拟在视网膜变性的RCS(Royal College of Surgeons)鼠早期进行干预,将BDNF基因转染的虹膜色素上皮细胞(iris pigment epitheium,IPE)(AAV-BDNF-IPE)移植入早期RCS大鼠视网膜下腔后,观察不同时期视网膜电图(electroretinogram, ERG)、视网膜组织BDNF表达及视网膜形态变化,分析移植后RCS鼠视网膜改善情况,为临床对由于RPE功能障碍以及感光细胞变性引起的疾病患者提供更多的思路。方法本研究通过以下四部分进行:第一部分:出生后18-22天(3周龄)RCS大鼠48只,雌雄不拘。通过改进的巩膜外路移植法将AAV-BDNF-IPE细胞移植到RCS大鼠双眼视网膜下腔,术后观察眼底情况,并行HE染色,观察移植细胞的存活情况。第二部分:SD正常对照大鼠,按照出生后3周龄、6、8、10、12、14周龄分组,每周龄组3只,共18只,RCS大鼠及AAV-BDNF-IPE细胞移植RCS大鼠(已在第一部分实验中完成AAV-BDNF-IPE细胞移植)各18只,按出生后周龄分组同SD大鼠,分别行双眼暗适应ERG记录,电生理检查参照国际临床视觉电生理标准。每次每眼至少检查3次,叠加后取波形稳定、干扰小的ERG图形,计算ERG-a、b波振幅值并进行统计学处理。第三部分:对照组RCS大鼠按照出生后3周龄、6、8、10、12、14周龄分组,每周龄组4只,共24只;AAV-BDNF-IPE细胞移植RCS大鼠(已在第一部分实验中完成AAV-BDNF-IPE细胞移植)24只,按出生后周龄分组同对照组RCS大鼠。分别于相应时间点即手术当天、术后3、5、7、9、11周取双眼球,用酶联免疫吸附法(Elisa)检测视网膜组织中BDNF的表达水平,比较分析这些数据并进行统计学处理。第四部分:实验动物及分组同第二部分,行电生理检测后处死大鼠,取出双眼球,取视网膜组织进行HE染色、TUNEL染色和免疫组化染色检测。结果1.共计43只RCS大鼠实施了双眼视网膜下腔移植,发生大量玻璃体积血、广泛视网膜脱离、眼内炎及误注入玻璃体腔18眼。AAV-BDNF-IPE细胞成功移植入视网膜下腔68眼,手术成功率79%。RCS大鼠视网膜及睫状体部位HE染色发现,睫状体及视网膜均缺乏色素细胞层;AAV-BDNF-IPE细胞移植到RCS大鼠视网膜下腔5周后,HE染色可见大鼠视网膜下腔有散在存活的褐色上皮细胞,推测为移植后存活的AAV-BDNF-IPE细胞;视网膜或脉络膜内未见明显炎性细胞浸润反应及结构破坏(Fig.6)。2.三组大鼠成功完成暗适应FERG记录,从出生后第3周到第14周,共记录正常SD大鼠15只30次,未干预对照RCS大鼠15只30次,细胞移植组RCS大鼠17只34次。三组大鼠生后8周内FERG的暗适应最大反应a、b波振幅无明显差别,出生10周以后RCS大鼠FERG的暗适应最大反应a、b波振幅均明显降低,与同周龄正常SD大鼠相比显著下降(P﹤0.05),出生12周以后RCS大鼠ERG波形呈低平型,未见明显波峰波谷,a、b波模糊。AAV-BDNF-IPE移植手术组RCS大鼠出生后10周龄时b波仍保持较高水平,尽管细胞移植组RCS大鼠b波呈现缓慢下降趋势,但振幅仍显著高于同周龄未干预对照组RCS大鼠(12w和14w组P<0.05)。3.对照组RCS大鼠出生后3周龄时视网膜组织中BDNF仍保持较高水平,其后迅速降低,其中3周龄组与其它周龄组比较,P<0.01;手术组RCS大鼠术时、术后3、5、7、9、11周各组间两两比较,BDNF表达无显著差异(P﹥0.05);出生后6周龄直到14周龄的不同时期,AAV-BDNF-IPE移植手术组RCS大鼠视网膜BDNF表达水平均明显高于对照组(其中6周龄组P<0.05,其它各周龄组P<0.01)。4. HE染色结果示:AAV-BDNF-IPE移植手术组和对照组相比视杆层靠近外核层的一侧厚度略有改善;TUNEL结果:实验组凋亡指数减少,凋亡峰值后延,凋亡高峰发生于移植术后9wk;免疫组化染色结果示:实验组大鼠原外层视网膜部位GFAP呈弱阳性表达,Muller细胞着色较浅;SYN除内丛状层着色外,外丛状层呈弱阳性反应。小结1、本实验采用自制的注射器,经单通道巩膜外路法成功将AAV-BDNF-IPE移植至幼年RCS大鼠视网膜下腔,有效缩小了巩膜切口,减少了视网膜解剖结构的破坏,手术成功率达到79%。RCS大鼠视网膜及睫状体部位HE染色发现,睫状体及视网膜均缺乏色素细胞层;AAV-BDNF-IPE细胞移植到RCS大鼠视网膜下腔5周后,HE染色可见大鼠视网膜下腔有散在存活的褐色上皮细胞,推测为移植后存活的AAV-BDNF-IPE细胞;视网膜或脉络膜内未见明显炎性细胞浸润反应及结构破坏。虽然不能判定移植细胞与其宿主视网膜组织间建立了正确的解剖联系,但我们的实验结果证实,通过改进的巩膜外路移植法将AAV-BDNF-IPE细胞移植至视网膜下腔,移植细胞不但能够较长期存活,而且不发生免疫排斥反应,是安全可靠的。2、本实验发现SD正常对照大鼠、RCS大鼠及AAV-BDNF-IPE细胞移植RCS大鼠三组大鼠生后8周内FERG的暗适应最大反应a、b波振幅无明显差别,出生10周以后RCS大鼠FERG的暗适应最大反应a、b波振幅均明显降低,与同周龄正常SD大鼠相比显著下降(P﹤0.05),出生12周以后RCS大鼠ERG波形呈低平型,未见明显波峰波谷,a、b波模糊,这些结果证实RCS大鼠视网膜色素变性进展过程中,视网膜功能逐步丧失。RCS大鼠视网膜电图的改变滞后于视网膜形态改变。将AAV-BDNF-IPE细胞移植入RCS大鼠视网膜下腔后,可以明显改善FERG b波振幅,尽管随着术后时间延长,细胞移植组RCS大鼠b波呈现缓慢下降趋势,但出生后10周龄后b波仍保持相对较高水平,且振幅显著高于同周龄未干预对照组RCS大鼠(12w和14w组P<0.05),提示AAV-BDNF-IPE细胞移植可以在一定程度上延缓RCS大鼠视网膜色素变性的进展,改善部分视网膜功能。3.对照组RCS大鼠出生后3周龄时视网膜组织中BDNF仍保持较高水平,其后迅速降低;出生后6周龄直到14周龄的不同时期,AAV-BDNF-IPE移植手术组RCS大鼠视网膜BDNF表达水平均明显高于对照组。这些结果表明,BDNF基因转染的虹膜色素上皮细胞在RCS大鼠视网膜下腔移植后,视网膜组织中BDNF可以持续稳定高水平表达,这是AAV-BDNF-IPE移植改善宿主视网膜功能的一个重要原因。4. AAV-BDNF-IPE细胞移植效果比未干预组略好:视杆层靠近外核层的一侧厚度也略有改善,这与以往的研究一致;TUNEL检测证实视细胞的丧失是一种凋亡现象,也提示AAV-BDNF-IPE的治疗可能是抑制细胞凋亡而发挥作用的;免疫组化结果提示可能减轻了代偿反应性胶质纤维增生,也可能表现了以突触恢复为特征的超微结构的变化。综上所述,该实验延缓了视网膜变性的进一步发展,表明这一方法可能拯救变性的光感受器,使之重新恢复功能。

全文目录


摘要  5-9
abstract  9-14
专业名词缩写中英文对照表  14-16
前言  16-19
第一部分 改进的巩膜外路法行 RCS 大鼠视网膜下腔AAV-BDNF-IPE 移植  19-27
  引言  19
  材料试剂  19-21
  实验方法  21-24
  结果  24-25
  讨论  25-26
  小结  26-27
第二部分 RCS大鼠视网膜下腔移植AAV-BDNF-IPE 细胞后 视网膜电图变化  27-36
  引言  27
  材料试剂  27-28
  实验方法  28-30
  结果  30-33
  讨论  33-34
  小结  34-36
第三部分 AAV-BDNF-IPE 移植后 RCS 鼠视网膜 BDNF 表达观察  36-41
  引言  36
  材料试剂  36-37
  实验方法  37
  结果  37-39
  讨论  39-40
  小结  40-41
第四部分 AAV-BDNF-IPE 移植后RCS鼠视网膜形态及细胞凋亡研究  41-50
  引言  41
  材料试剂  41-42
  实验方法  42-45
  结果  45-47
  讨论  47-48
  小结  48-50
本研究创新性的自我评价  50-51
参考文献  51-55
综述  55-62
  参考文献  59-62
致谢  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 视网膜及视神经疾病 > 视网膜疾病
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