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HCV 1b型全基因组扩增及序列分析

作 者: 郭艳
导 师: 毛青
学 校: 第三军医大学
专 业: 内科学
关键词: 丙型肝炎病毒 全基因组 长链逆转录聚合酶链反应 复制子 系统进化树
分类号: R392.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


背景和目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染是全球性公共卫生问题,目前全世界感染人数约1.7亿,其中85%将发展成为慢性丙型肝炎。现有的抗HCV唯一标准治疗方案是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林,但该疗法对病毒基因型有很强的依赖性,2、3型感染者获得持续病毒学应答(sustained virological response, SVR)率为70%~90%,而1、4型感染者仅为40%~60%。缺乏高效的体外细胞复制体系和小动物模型是阻碍HCV致病机制研究及抗病毒药物研发的主要原因。1999年Lohmann等建立的选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统标志着HCV体外培养技术的一大进步,为HCV的基础研究和药物筛选提供了一个新的平台。该亚基因组复制子将编码结构蛋白的基因删除,用2个异源性成分取而代之,其一为选择性标志物新霉素磷酸转移酶(neo)基因,其二为脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site IRES)。上游顺反子在HCV IRES作用下启动新霉素磷酸转移酶基因表达,下游顺反子在EMCV IRES作用下启动HCV NS3~5B蛋白质的翻译。通过转染Huh-7细胞和G418筛选,获得的选择性HCV RNA复制子虽能在Huh-7细胞中稳定高效地自主复制,但需细胞培养适应性突变,且转染效率极低。由于结构基因的删除,HCV亚基因组复制子不能产生完整的病毒颗粒,无法用于HCV生活周期、病毒组装释放及HCV结构蛋白的研究。之后研究者用HCV全长基因组替换亚基因组复制子的NS3~5B,构建了HCV全基因组复制子。同亚基因组复制子一样,全基因组复制子也需进行体外适应性突变后才能获得高效的复制能力,且同样无法产生感染性病毒颗粒,不能完全代表HCV在体内的复制过程。2005年JFH-1体外细胞培养体系的建立成为HCV发展史上的里程碑。JFH-1系从日本1例暴发性丙型肝炎患者体内分离获得,其基因型为HCV 2a型,是迄今唯一无需适应性突变即能在体外高效复制并产生感染性病毒颗粒的毒株。然而,HCV是一具有高度异质性的病毒,JFH-1与其他基因型病毒株在生物学性状、临床特征及治疗效果等方面均有很大差异,无法代表所有HCV的特性。因此,建立能产生完整病毒颗粒的HCV各基因型细胞培养模型是当前HCV研究的重要任务。获取HCV全长基因组序列是构建HCV体外细胞培养模型的基础。目前国内外虽已构建了大量的HCV全基因组克隆,但均是通过短片段扩增、拼接而成。由于HCV存在极其复杂的准种特性,这种多片段拼接易造成不同变异株间的错误连接,得到的只是人工重组体,而不是患者体内真实存在的病毒基因组。采用长链RT-nested-PCR方法一次性扩增出HCV基因组全长片段可以完全避免上述问题,但难度很大,国内外均未获成功。HCV基因组具有复杂的二级结构、鸟嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine,GC)含量高、血清HCV RNA浓度低、难以通过逆转录获得长9.6kb的完整cDNA模板等都是导致HCV全基因组扩增失败的原因。目前报道的从患者血清一次性扩增出的HCV基因组最长片段为9.1kb,其扩增片段未包含病毒基因组包装和复制所必须的结构3’UTR,无法用于体外细胞培养模型的建立。针对上述问题,本课题通过对HCV全基因组长链RT-nested-PCR扩增方案的不断摸索、优化,旨在一次性扩增出包括5’、3’UTR在内的HCV基因组全长,构建真实可靠的HCV全基因组克隆,为进一步构建HCV体外细胞培养模型奠定基础。本研究分为三个部分:第一部分以pJFH-1质粒为模板,通过优化长链PCR反应体系及条件,建立适用于HCV全基因组扩增的长链PCR方案;第二部分在第一部分的基础上,改进HCV长链RT及nested-PCR方案,建立从血清一次性扩增HCV基因组全长的长链RT-nested-PCR方法,并构建HCV全长基因组克隆,为建立中国人HCV体外复制子模型奠定基础;第三部分对所克隆HCV全基因组序列进行基因分型、进化分析,并对其复制能力进行了初步预测,为下一步构建HCV体外细胞复制模型提供理论依据。材料和方法:1.HCV长链PCR方法的建立和优化:以pJFH-1质粒为测试模板,通过长链PCR引物的筛选、PCR DNA聚合酶的比较、甘油或/和DMSO最适浓度的筛选、循环条件的摸索等,建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方案。2.HCV长链RT-nested-PCR方法的建立和优化:以GenBank中所有HCV全长序列为参考,在Poly(U/UC)区后选择相对保守、GC含量适宜的区域进行长链RT及nested-PCR引物的设计。由于HCV全长约9.6kb,获得完整cDNA难度很大,因此在5’UTR和NS5B区各设计了一对PCR引物用于验证cDNA完整性。通过长链RT及nested-PCR引物的筛选、多种RNA提取方法的比较、RT反应体系及条件的优化、长链nested-PCR方案的优化,建立HCV全长RT-nested-PCR扩增方案。3.HCV全基因组克隆的构建:将获得的HCV全基因组片段通过胶回收纯化、TA克隆、转化TOP10感受态细胞获得HCV全长基因组克隆并验证。4.HCV全长序列的分析:通过对测序结果处理、拼接获得HCV全长序列。绘制系统进化树进行同源性分析,并对其复制能力进行初步预测,为下一步构建HCV体外细胞复制模型提供理论依据。结果:1.建立了HCV全基因组长链RT-nested-PCR扩增方案:设计的长链RT引物(RTP-1)及nested-PCR引物(外侧引物对ESP-1、EAP-1;内侧引物对ISP-1、IAP-1)能稳定扩增出HCV基因组全长;采用Qiagen公司的QIAamp viral RNA mini kit提取可得到完整的RNA模板; RT反应选用invitrogen公司的SuperScript III,用优化的RT条件进行逆转录反应可获得完整的cDNA。长链nested-PCR选用invitrogen公司的Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity,反应条件为94℃2min;94℃15sec、68℃9.5min,15个循环;94℃15sec、68℃9.5min+10sec/cycle,20个循环;然后68℃10min可成功实现HCV全长的扩增。2.构建了HCV全基因组克隆:将HCV全长PCR产物经TA克隆获得了6个HCV全基因组克隆(命名为CQFL 1~6),并经质粒直接电泳分析及内侧引物对(ISP-1、IAP-1)扩增HCV全长验证,提示HCV全长基因组克隆构建成功。3.序列分析得知所克隆HCV基因组为HCV 1b型,与新加坡1b株(accession no. AF356827)亲缘性最近。通过NS5B区氨基酸序列分析发现:相对于其他HCV 1b株而言,有4个位点氨基酸为CQFL 1~6所特有,分别为250K、424V、435V、564V,其中后3个位点的氨基酸与JFH-1相应位点氨基酸一致。推测CQFL 1~6 NS5B的空间结构可能较其他不具复制能力的HCV 1b株更接近于JFH-1, RdRp的活性更高,故可能具有体外自主复制的能力。结论:1.建立了HCV全基因组长链RT-nested-PCR方案,为从患者血清一次性扩增出HCV全长基因组及其他RNA病毒的长链扩增提供了参考。2.构建了HCV全基因组克隆,并对其复制能力进行了初步预测,为构建中国人HCV全基因组体外复制子模型奠定了基础。

全文目录


英文缩写词表  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-12
前言  12-14
第一部分 基于pJFH-1 的HCV 基因组全长PCR 方法的建立  14-25
  前言  14
  材料与方法  14-19
  结果  19-22
  讨论  22-25
第二部分 HCV 1b 型全基因组扩增及克隆的构建  25-52
  前言  25
  材料与方法  25-44
  结果  44-48
  讨论  48-52
第三部分 HCV 1b 型全基因组序列分析  52-62
  前言  52
  材料与方法  52-53
  结果  53-60
  讨论  60-62
全文总结与研究展望  62-63
致谢  63-64
参考文献  64-68
文献综述 丙型肝炎病毒复制子系统的研究进展  68-76
  参考文献  72-76
硕士阶段撰写的学术论文  76

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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