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几丁质酶的体外定向进化研究

作 者: 徐敏
导 师: 于平
学 校: 浙江工商大学
专 业: 生物化工
关键词: 定向进化 易错PCR 高通量筛选 培养基优化 表达纯化 酶学性质
分类号: Q814
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


几丁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)通过p-1,4-糖苷键连接而成的高分子聚合物,是仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质的中间降解产物几丁寡糖是一种具有独特生理活性的功能性低聚糖,分子量小、溶解性好、易于吸收的特性使其在生物医药、食品、化妆品、纺织、农业等各领域都有广泛的应用价值。与国外相比,我国对几丁质酶水解几丁质得到几丁寡糖的研究起步较晚,且其酶活力不高,不能满足产业化要求,因此提高几丁质酶的水解活力具有非常大的意义。本课题组已完成了以大肠杆菌表达系统克隆表达绿色木霉内切几丁质酶基因的工作。本课题以该基因作为起始材料,通过定向进化策略和高通量筛选手段提高了内切几丁质酶的活力;对高活力突变株的发酵培养基进行优化;对重组蛋白进行表达、纯化并研究其酶学性质。主要研究结果如下所述:利用易错PCR技术,以重组质粒pET-28a(+)-MECHs为模板构建突变体库,用于高通量筛选。从原始菌株BL21/pET-28a(+)-MECHs出发经过一轮定向进化,筛选得到突变菌株MECH118,其酶活是原始菌株的1.81倍。测序结果表明,目的基因有9个碱基发生了突变:G69A,T276C,C300T,A554T,T676C,A1002G,T1168A,A1169G,G1170C。由此导致氨基酸序列第185位酪氨酸突变为苯丙氨酸Y185F,第226位丝氨酸突变为脯氨酸S226P。采用两水平部分因子实验设计研究了发酵培养基各组分对内切几丁质酶比活力的影响,得出主要影响因子为Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和葡萄糖。三者在95%的概率水平上对菌体产酶都有正效应。然后采用BBD确定各主要影响因子的最佳作用浓度,得到优化的发酵培养基组成(g/L):Na2HPO4·12H2O 16.8,MgSO4·7H2O 0.14,NH4Cl 1, KH2PO4 2,蛋白胨14,葡萄糖8.8,酵母粉6。在优化发酵培养基中供试菌株的比活力是未优化发酵培养基中的1.67倍。发酵液经硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析得到电泳纯内切几丁质酶。结果表明,粗酶液比活力从0.537×10-3(U/mg)提高到5.194×10-3(U/mg),纯化倍数为9.67倍,回收率为8.1%。同时SDS-PAGE电泳结果显示,经各步纯化操作得到一条单一的蛋白条带,作图法求得该酶的分子量为46.77 kD。对纯化后内切几丁质酶的酶学性质进行研究,在pH7.0和37℃反应条件下,该酶水解底物PNPG的Km值为0.2514 mmol/L,最大反应速度Vmax为4.5872μmol/L·min-1。与优化前所产几丁质酶比较,优化后酶的最适反应温度仍为60℃,但热稳定性下降;最适反应pH为7.4,比优化前略小。对比9种不同金属离子对优化后酶的活性影响,Mn2+、Mg2+和Ba2+对该酶有比较明显的激活作用,Zn2+、Cu2+和Co2+对该酶有明显的抑制作用,而Na+、K+和Ca2+对该酶则无明显的作用。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-9
目录  9-13
第1章 引言  13-22
  1.1 背景  13-14
  1.2 研究进展  14-19
    1.2.1 定向进化概述  14-15
    1.2.2 定向进化策略  15-19
      1.2.2.1 易错PCR  15-17
      1.2.2.2 DNA改组  17
      1.2.2.3 突变体筛选策略  17-19
    1.2.3 定向进化的应用  19
  1.3 研究目的和意义  19-20
  1.4 研究思路  20-21
  1.5 技术路线  21-22
第2章 利用易错PCR技术构建突变体文库  22-42
  2.1 材料  22-24
    2.1.1 实验菌株及质粒  22
    2.1.2 培养基  22-23
    2.1.3 试剂  23-24
      2.1.3.1 核酸电泳试剂  23
      2.1.3.2 其他试剂  23
      2.1.3.3 实验用酶类、核酸标准及试剂盒  23-24
    2.1.4 主要仪器设备  24
  2.2 实验方法  24-32
    2.2.1 菌种活化与培养  24
    2.2.2 质粒提取  24-25
    2.2.3 引物设计  25-26
    2.2.4 易错PCR  26-27
    2.2.5 重组质粒pET-28a(+)-MECH的构建  27-29
      2.2.5.1 表达载体pET-28a(+)与PCR产物的双酶切  27-29
      2.2.5.2 载体pET-28a(+)与目的基因MECH的连接  29
    2.2.6 重组质粒转化宿主菌  29-30
      2.2.6.1 感受态细胞的制备  29-30
      2.2.6.2 转化  30
    2.2.7 转化子的鉴定  30-32
      2.2.7.1 转化子的鉴定  30-31
        2.2.7.1.1 标准PCR鉴定  30-31
        2.2.7.1.2 双酶切鉴定  31
      2.2.7.2 转化子的保存  31-32
  2.3 结果与讨论  32-40
    2.3.1 质粒提取  32-33
    2.3.2 易错PCR  33-35
    2.3.3 表达载体pET-28a(+)与ep-PCR产物的双酶切  35
    2.3.4 重组质粒的构建流程  35-37
    2.3.5 重组质粒转化宿主菌  37
    2.3.6 转化子的鉴定  37-40
      2.3.6.1 标准PCR鉴定  38-39
      2.3.6.2 双酶切鉴定  39-40
    2.3.7 转化子的保存  40
  2.4 本章小结  40-42
第3章 突变文库的高通量筛选  42-52
  3.1 材料  42-43
    3.1.1 试剂  42
    3.1.2 主要仪器设备  42-43
    3.1.3 耗材、标准品  43
    3.1.4 细胞培养板的处理方法  43
  3.2 实验方法  43-45
    3.2.1 活化  43
    3.2.2 菌株培养与诱导  43
    3.2.3 筛选方法  43-44
    3.2.4 PNP标准曲线的建立  44
    3.2.5 生长曲线的测定  44
    3.2.6 优化菌株的序列测定  44-45
  3.3 结果与讨论  45-51
    3.3.1 活化  45
    3.3.2 PNP浓度标准曲线  45
    3.3.3 重组菌生长曲线测定  45-46
    3.3.4 高通量菌株筛选  46-48
    3.3.5 优化菌株的序列分析  48-51
  3.4 本章小结  51-52
第4章 发酵培养基的成分优化  52-62
  4.1 材料  52-53
    4.1.1 实验菌株  52
    4.1.2 培养基  52
    4.1.3 试剂  52-53
    4.1.4 主要仪器设备  53
  4.2 实验方法  53-54
    4.2.1 部分因子实验设计(Fractional Factorial Design,FFD)  53
    4.2.2 Box-Behnken实验设计(Box-Behnken Design,BBD)  53
    4.2.3 测定方法  53-54
      4.2.3.1 粗酶液的制备  53-54
      4.2.3.2 酶活的测定  54
      4.2.3.3 蛋白质的定量  54
  4.3 结果与讨论  54-61
    4.3.1 蛋白标准曲线的制作  54-55
    4.3.2 部分因子实验设计  55-57
    4.3.3 Box-Behnken实验设计  57-61
  4.4 本章小结  61-62
第5章 几丁质酶的分离纯化  62-72
  5.1 材料  62-64
    5.1.1 菌株  62
    5.1.2 培养基  62
    5.1.3 试剂  62-64
      5.1.3.1 柱层析缓冲液  62
      5.1.3.2 蛋白质电泳试剂  62-64
    5.1.4 主要仪器设备  64
    5.1.5 其他  64
  5.2 实验方法  64-68
    5.2.1 粗酶液的制备  64-65
    5.2.2 盐析  65
      5.2.2.1 盐析曲线的制作  65
      5.2.2.2 盐析  65
    5.2.3 DEAE阴离子交换层析  65-66
      5.2.3.1 填料处理与再生  65
      5.2.3.2 装柱  65-66
      5.2.3.3 层析  66
    5.2.4 凝胶过滤层析  66-67
      5.2.4.1 凝胶的溶胀  66-67
      5.2.4.2 装柱  67
      5.2.4.3 层析  67
    5.2.5 纯化效率  67-68
  5.3 结果与讨论  68-71
    5.3.1 盐析  68
    5.3.2 DEAE离子交换层析  68-69
    5.3.3 凝胶过滤纯化  69-70
    5.3.4 纯化效率  70-71
  5.4 本章小结  71-72
第6章 几丁质酶的性质研究  72-78
  6.1 材料  72
    6.1.1 实验菌株  72
  6.2 实验方法  72-73
    6.2.1 分子量测定  72
    6.2.2 动力学常数K_m值的测定  72
    6.2.3 温度对突变酶和原始酶活性的影响及其热稳定性研究  72-73
    6.2.4 pH对突变酶和原始酶活性的影响及其酸碱稳定性研究  73
    6.2.5 金属离子种类与强度对几丁质酶活性的影响  73
  6.3 结果与讨论  73-77
    6.3.1 分子量测定  73-74
    6.3.2 动力学常数K_m值的测定  74
    6.3.3 温度对突变酶和原始酶活性的影响及其热稳定性研究  74-75
    6.3.4 pH对突变酶和原始酶活性的影响及其酸碱稳定性研究  75-76
    6.3.5 金属离子种类与强度对几丁质酶活性的影响  76-77
  6.4 本章小结  77-78
第7章 结论  78-81
  7.1 结论  78-79
  7.2 创新点  79
  7.3 进一步研究的内容和建议  79
  7.4 研究展望  79-81
参考文献  81-88
致谢  88-89

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学(生物技术) > 酶工程
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