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印度洋表层海水石油降解菌多样性分析及生物表面活性剂发酵工艺优化

作　者: 吴常亮
导　师: 邵宗泽
学　校: 国家海洋局第三海洋研究所
专　业: 微生物学
关键词: 印度洋石油降解菌 DGGE 多样性生物表面活性剂定量分析响应面法最优化
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

海洋微生物在海洋石油污染的自然消除及生物修复中发挥着重要的作用。本文利用2007年“大洋一号”第19次科考期间从德班到珀斯走航过程中采集的印度洋表层海水,通过石油富集,对降解菌多样性进行了分析。此外,本文还对石油降解菌Alcanivorax dieselolei B-5进行了产表面活性剂的发酵培养基优化。主要研究内容及结论如下：(1)为了研究印度洋石油降解菌多样性,并获得新的石油降解菌。本研究通过印度洋表层海水样品采集、以柴油与原油1：1混合物作为碳源,从中富集、分离筛选石油降解菌,并通过PCR-DGGE对13个站点富集菌群的菌群结构进行分析。通过形态观察、生理生化反应和16SrRNA分析,共得到29个属的51株不同的细菌,它们主要是属于α亚群和γ亚群。其中,Alcanivorax属(占18%),Novosphingobium属(占10%),Marinobacter(占6%)和Thalassospira(占6%)为主要的优势菌。通过生态多样性分析表明,Shannon-Winner指数(H)为4.57968,说明其具有较高的多样性;均匀度指数(E)为0.8664771,表示其分布比较均匀。单菌实验表明,49株具有石油降解能力,其中,Sinomonas, Knoellia, Mesoflavibacter等属的细菌为首次发现有降解能力。DGGE分析表明Alcanivorax属的细菌是印度洋表层海水中的重要石油降解菌。本研究首次揭示了印度洋表层海水中石油降解菌的多样性,并获取了若干在海洋石油污染生物修复中具有应用前景的降解菌。(2)由于缺乏快速有效准确的方法,生物表面活性剂产量的定量一直是一个耗时且困难的工作。本研究旨在利用表面活性剂在低pH时会形成沉淀而浑浊的原理,将浑浊度与标准曲线结合,用于定量表面活性剂的产量。由不同碳源诱导菌株A. dieselolei B-5所产的表面活性剂经配成标准浓度后沉淀,实验表明浑浊度与标准浓度制成的曲线具有良好的线性相关性。经MSM、MMSM和DMSM培养基验证后显示,该方法可适用于多种培养基中生物表面活性剂产量的定量。利用以上实验的表面活性剂产量定量方法为检测手段。本研究对菌株A.dieselolei B-5产生的生物表面活性剂进行了发酵培养基的优化。采用Plackett-Burman设计进行优化实验,结果分析表明,影响表面活性剂产量的3个重要的培养基成分为：液体石蜡、TWEEN-80、SrCl2。进一步用Design Expert软件的响应面回归方法对培养基进行了优化。结果表明,其最适浓度分别为33.18ml/L、4.15 ml/L和0.22 g/L。此时表面活性剂的产量为最大(4.31 g/L),比优化前提高了95.91%。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第一章前言  14-35
  1.1 海洋石油污染的现状  14
  1.2 海洋石油污染的危害  14-16
    1.2.1 海洋石油污染的生态危害  14-15
    1.2.2 海洋石油污染的社会危害  15-16
  1.3 目前石油污染的修复技术  16-18
  1.4 石油微生物降解机理  18-23
    1.4.1 微生物对烷烃的代谢  18-21
    1.4.2 微生物对芳香烃的代谢途径  21-23
    1.4.3 微生物在厌氧条件下对石油烃的代谢  23
  1.5 石油烃生物降解国内外研究现状及其发展  23-26
    1.5.1 国外研究现状  23-25
    1.5.2 国内研究现状  25-26
  1.6 生物表面活性剂的应用  26-27
    1.6.1 表面活性剂在生物降解中的应用  26
    1.6.2 表面活性剂在微生物采油中的应用  26-27
  1.7 生物表面活性剂定量方法  27-28
  1.8 培养基对生物表面活性剂的影响  28-30
    1.8.1 烃类对生物表面活性剂生产的影响  28
    1.8.2 氮源对生物表面活性剂生产的影响  28-29
    1.8.3 其他营养成份和生长条件对生物表面活性剂生产的影响  29-30
  1.9 产表面活性剂发酵培养基优化的方法  30-33
    1.9.1 非统计学方法  30
    1.9.2 统计学方法  30-33
      1.9.2.1 正交实验设计  30-31
      1.9.2.2 均匀实验设计  31
      1.9.2.3 Plackett-Burman法  31
      1.9.2.4 部分因子设计法  31-32
      1.9.2.5 响应面分析法  32-33
  1.10 本文的研究目的及意义  33-35
第二章印度洋表层海水石油降解菌的多样性分析  35-46
  2.1 材料和方法  35-37
    2.1.1 表层海水采样与降解菌富集  35-36
    2.1.2 培养基  36
    2.1.3 菌株的富集和分离培养  36-37
    2.1.4 1 6S rRNA序列的扩增  37
    2.1.5 1 6S rRNA的V3区PCR扩增  37
  2.2 结果  37-44
    2.2.1 基于可培养菌株16S rRNA序列测定的多样性分析  37-43
    2.2.2 降解菌群DGGE分析  43-44
  2.3 讨论  44-46
第三章菌株Alcanivorax dieselolei B-5产表面活性剂培养基的统计学优化  46-65
  3.1 材料与方法  46-51
    3.1.1 菌种  46
    3.1.2 培养基  46-48
    3.1.3 试剂  48
    3.1.4 仪器  48-49
    3.1.5 实验方法  49-51
      3.1.5.1 乳化系数法(EI24%)  49
      3.1.5.2 生物表面活性剂抽提方法  49
      3.1.5.3 制作表面活性剂产量标准曲线  49-50
      3.1.5.4 A.dieselolei B-5的扩大培养和发酵培养  50
      3.1.5.5 统计学方法进行产表面活性剂培养基的优化  50-51
        3.1.5.5.1 Pluckett—Burman二水平实验设计  50-51
        3.1.5.5.2 响应曲面法(Box-Behnken)优化培养基  51
  3.2 结果  51-63
    3.2.1 EI24%-产量法确定发酵时间  51-52
    3.2.2 表面活性剂产量标准曲线的制作  52-54
    3.2.3 Plackett-Burman设计法筛选培养基成分的重要因素  54-57
    3.2.4 响应曲面法(Box-Behnken)优化培养基  57-63
    3.2.5 验证实验  63
  3.3 讨论  63-65
小结和展望  65-67
  1. 印度洋石油降解菌方面小结  65
  2. 生物表面活性剂方面小结  65-66
  3. 展望  66-67
参考文献  67-76
硕士期间发表论文目录  76-77
致谢  77

印度洋表层海水石油降解菌多样性分析及生物表面活性剂发酵工艺优化

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