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厚朴遗传多样性和遗传关系研究及ITS序列分析

作 者: 于华会
导 师: 杨志玲
学 校: 中国林业科学研究院
专 业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 厚朴 引物筛选 ITS序列分析 ISSR分子标记 遗传多样性 遗传结构
分类号: S567.11
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 116次
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内容摘要


厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils)属木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)落叶乔木,被列为国家二级濒危保护植物。因其种类原始、分类地位特殊,且药用价值极高,而备受关注。随着社会对其需求量的增加,受利益的驱使,人们大量盗挖野生厚朴资源,致使目前其野生种群的数目和规模都在不断变小,呈散生状态,生境逐渐片断化,自然种群间的基因交流受阻,生存现状令人担忧,开展厚朴种群相关研究已迫在眉睫。本文利用ISSR分子标记技术对厚朴种群遗传多样性和遗传关系进行研究,探索厚朴种群的遗传多样性及地域遗传分化,从分子水平揭示其濒危的原因,并提出相应保护策略;同时本文还利用ITS序列分析技术对11个主产区的厚朴ITS序列碱基变异进行了研究,为产区间厚朴的引种及道地性鉴定提供分子方面的证据。主要研究结果如下:(1)厚朴基因组DNA提取方法研究结果运用SDS-CTAB结合法、SDS法、CTAB法及高盐低pH法对厚朴基因组DNA进行提取,以SDS-CTAB结合法效果最佳,特别是高浓度NaAc的引入及相应冻融,可明显提高所得厚朴基因组DNA纯度;同时采用石英砂和4% PVP溶液代替液氮研磨叶片,也可达到较好效果。(2)ISSR引物筛选及条件优化研究结果通过正交试验确定了影响厚朴ISSR-PCR反应的各项参数。其中扩增体系为:引物浓度0.3μmol?L-1,Taq酶0.04 U?μl-1,DNA浓度4 ng?μl-1,Mg2+与dNTP浓度分别为1.5和0.2 mmol?L-1;扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,50℃~60℃(退火温度随引物不同而定)退火45 s,72℃延伸90 s,共40个循环,然后72℃延伸8 min,4℃终止反应。最后,还利用该体系成功筛选出21条可用于厚朴遗传多样性及遗传关系研究的ISSR引物。(3)不同产区厚朴ITS序列分析结果对11个产区厚朴ITS序列分析发现,厚朴ITS全序列长度介于593~600bp(不考虑Gap,ITS1序列长度为214~217bp,ITS2序列长度为215~219bp,5.8S rDNA编码区极为保守,片段长度为164bp),并有33个变异位点(Gap做缺失处理,全部发生在ITS1和ITS2序列),且碱基频率及含量也呈现一定的变化(ITS1和ITS2序列GC含量分别为54.42%~55.35%和59.82%~60.95%,5.8S无变化,为46.95%);遗传距离和聚类分析显示出部分厚朴产区间的亲缘关系,反映了我国厚朴全国引种栽培的现状。同时还发现产区间厚朴ITS序列位点变异与其叶形的变化不存在必然联系。(4)厚朴种群遗传多样性及遗传关系分析结果利用ISSR标记对28个厚朴种群666个个体进行扩增,开展厚朴遗传多样性及遗传关系研究,结果表明,12条ISSR引物均能在所有个体中稳定扩增,共扩增出137条带,其中114条为多态性条带,多态位点百分比(PPB)介于75.00%-91.67%;厚朴在物种水平拥有较高的遗传多样性(PPB=83.21%,H=0.342),而在种群水平遗传多样性却相对较低(PPB=49.76%,H=0.194),这可能与厚朴形成的特殊历史原因有关;28个厚朴种群间遗传多样性指标呈现差异,但各种群间的遗传多样性指标均与海拔、经纬度的变化无关(Pearson correlation test,P>0.05);28个厚朴种群间已经产生一定程度的分化,且种群内的遗传分化大于种群间(GST=0.4278)。AMOVA(Analysis of molecular variance)分析结果与其相吻合,并且表明厚朴种群间和种群内均发生了显著的遗传分化(AMOVA analysis,P<0.001);基于Nei遗传距离进行的NJ聚类,28个厚朴种群明显的被分为3组,与Structure遗传结构分析及主坐标分析(PCoA,2Dim and 3Dim)结果相吻合;基于种群地理距离自然对数和遗传距离的Mantel检测表明,厚朴种群的遗传分化(R=-0.0054,P=0.5120)不符合距离产生分化模型。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章 绪论  14-33
  1.1 引言  14-31
    1.1.1 研究背景  14-16
    1.1.2 国内外研究现状及评述  16-31
  1.2 研究目标和主要研究内容  31-32
    1.2.1 关键的科学问题与研究目标  31
    1.2.2 主要研究内容  31-32
  1.3 研究技术路线  32-33
第二章 不同方法对厚朴叶片总DNA 提取效果的影响  33-38
  2.1 材料与方法  33-35
    2.1.1 试验材料  33
    2.1.2 主要仪器  33
    2.1.3 主要药品与试剂配制  33-34
    2.1.4 DNA 提取方法与步骤  34-35
    2.1.5 DNA 检测  35
  2.2 结果与分析  35-37
    2.2.1 DNA 纯度检测  35-36
    2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测  36-37
    2.2.3 PCR 扩增检测  37
  2.3 小结  37-38
第三章 厚朴ISSR 引物筛选及反应条件优化  38-47
  3.1 材料与方法  38-40
    3.1.1 试验材料  38
    3.1.2 试验仪器及药品  38
    3.1.3 试验方法  38-39
    3.1.4 数据处理  39-40
  3.2 结果与分析  40-46
    3.2.1 DNA 质量  40
    3.2.2 ISSR-PCR 正交试验的直观分析  40-41
    3.2.3 各因素对厚朴ISSR-PCR 反应的影响  41-42
    3.2.4 各因素的不同水平对厚朴ISSR-PCR 扩增的影响  42-44
    3.2.5 最适退火温度的确定  44
    3.2.6 循环次数对ISSR-PCR 的影响  44
    3.2.7 厚朴特异ISSR 引物筛选及遗传多样性检测  44-46
  3.3 小结  46-47
第四章 不同产区厚朴ITS 序列分析  47-55
  4.1 材料和方法  47-48
    4.1.1 供试材料  47
    4.1.2 试验仪器及药品  47
    4.1.3 试验方法  47
    4.1.4 序列分析  47-48
  4.2 结果与分析  48-53
    4.2.1 引物扩增  48
    4.2.2 序列测定  48-50
    4.2.3 不同产区厚朴ITS 序列异同  50
    4.2.4 ITS 序列与叶形的关系  50
    4.2.5 不同产区厚朴遗传距离及系统树构建  50-53
  4.3 小结  53-55
第五章 厚朴种群遗传多样性及遗传关系分析  55-75
  5.1 材料和方法  55-57
    5.1.1 供试材料  55
    5.1.2 试验仪器及药品  55-56
    5.1.3 试验方法  56
    5.1.4 数据分析  56-57
  5.2 结果与分析  57-73
    5.2.1 厚朴种群PCR 扩增结果  57-61
    5.2.2 厚朴种群遗传多样性  61
    5.2.3 厚朴种群遗传多样性与经纬度海拔的关系  61-63
    5.2.4 厚朴种群间遗传分化及基因流  63
    5.2.5 厚朴种群间的遗传距离(D)及遗传一致度(GI)  63
    5.2.6 聚类分析  63-64
    5.2.7 厚朴种群遗传结构分析  64-67
    5.2.8 主坐标分析  67-69
    5.2.9 地理距离与遗传分化、遗传距离的相关性分析  69-73
  5.3 小结  73-75
第六章 结论与讨论  75-85
  6.1 不同方法对厚朴叶片总DNA 提取效果的影响  75-76
  6.2 厚朴ISSR 引物筛选及反应条件优化  76-77
  6.3 不同产区厚朴ITS 序列分析  77-79
    6.3.1 ITS 序列对于不同产区厚朴的鉴别  77-78
    6.3.2 ITS 序列与表型的关系  78-79
    6.3.3 ITS 序列的聚类及亲缘关系分析  79
  6.4 厚朴遗传学分析  79-84
    6.4.1 厚朴遗传多样性  79-80
    6.4.2 厚朴种群间遗传结构及分化  80-81
    6.4.3 种群间遗传关系及聚类分析  81-83
    6.4.4 厚朴资源的保护  83-84
  6.5 展望  84-85
参考文献  85-105
在读期间的学术研究  105-107
致谢  107

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 药用作物 > 木本 > 厚朴
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