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离子液体和聚苯胺纳米管修饰丝网印刷DNA生物传感器的应用研究

作 者: 冷翠翠
导 师: 张宜恒
学 校: 青岛科技大学
专 业: 应用化学
关键词: 丝网印刷电极 聚苯胺纳米管 离子液体 avidin-HRP 六氨基钌 金纳米颗粒 肿瘤细胞
分类号: TP212.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


本研究构建了掺杂导电油墨制作的丝网印刷电极,并将其用于对特定DNA片段和肿瘤细胞进行识别和测定,为许多疾病的临床早期诊断提供基础性研究。本文着重进行了三种类型的DNA传感器的研制和性质研究:1.丝网印刷电极的构建。合成了形貌、尺寸和电导率适当的聚苯胺纳米管,然后将室温离子液体与所合成的聚苯胺纳米管共同掺杂入导电油墨中,用于制造三电极丝网印刷DNA传感器中的工作电极,再用壳聚糖膜加以覆盖修饰电极。优化了掺杂和修饰条件,在最佳条件下所得的电极具有较低的表面阻抗和较高的电化学灵敏度。2.基于这个传感器建立了一种基于酶放大的DNA夹心检测的方法。将avidin修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)固定到杂交好的DNA上,通过HRP催化底物邻氨基酚和双氧水反应产生信号。在实验选定的最佳条件下,得到了目标DNA的线性范围为8×10-14-2×10-13 M,检测限为8.37×10-15 M。另外,三碱基错配序列和完全非互补序列的杂交情况同样被检测。其中,三碱基错配序列显示有微弱的电化学信号而完全非互补序列则无信号检出。这说明我们设计的DNA传感器具有良好的选择性。3.在以上工作的基础上,我们改进了实验方法,研究了另一种灵敏度更高的基于六氨基钌和金纳米粒子放大信号的电化学方法法检测DNA特定序列的生物传感器。首先,将巯基修饰的捕获DNA固定在纳米金修饰的丝网印刷电极表面,之后分别与目标DNA和标记金纳米粒子的3’位巯基修饰的检测探针、探针杂交,形成了“夹心”式的DNA杂交复合物。通过六氨基钌特异性吸附到纳米金结合的单链DNA中,六氨基钌发生氧化还原反应产生信号通过计时电量法检测信号进一步增强了检测的灵敏度。结合以上两种因素,该DNA传感器可检测到10-17的低浓度的目标DNA,并在三碱基错配DNA的测定上显示出良好的选择性。同时,对实验的最佳检测条件进行了选择。在最佳条件下进行检测,得到了目标DNA的8×10-17 M的检测限,检测的线性范围为1.0×10-16 M到1.0×10-14 M。4.我们又深入研究制作了一种可以检测肿瘤细胞的传感器。这种传感器是以Ramos肿瘤细胞的适体识别以及DNA序列的循环复制替换为基础构建的。这一检测方案分两步进行:首先,将适体序列DNA固定在磁珠上后与“信使序列”杂交,Ramos细胞与这一杂交复合体结合导致信使序列DNA释放出来;将发卡序列固定在电极上,释放出的信使序列与其“环”部分杂交,颈环部分被打开,再与金纳米颗粒结合的引物DNA杂交形成杂交复合体,并在DNA复制酶、脱氧三磷酸核苷酸混合物(dNTP)和镁离子存在下引发以引物为起点的DNA聚合反应,反应过程中形成一条与发卡探针互补的新链,同时信使序列DNA被替换而释放到溶液中,找到另一个发卡探针开始新的循环复制。引物序列上的纳米金颗粒同时附有分子条码序列,其上吸附有六氨基钌,通过计时电量法检测六氨基钌的氧化还原信号,进一步增强了检测的灵敏度。结合以上两种因素,该DNA传感器可检测到10-17的低浓度的目标DNA,也可以检测1 ml溶液中含有100个细胞,并在三碱基错配DNA的测定上显示出良好的选择性。同时,对含有其他干扰细胞时该传感器也可以显示出良好的选择性。该研究还对实验的最佳检测条件进行了选择。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-14
第一章 综述  14-26
  1.1 DNA 生物传感器简介  14-18
    1.1.1 丝网印刷DNA 生物传感器简介  14
    1.1.2 生物传感器  14-15
    1.1.3 生物传感器的测定过程  15
    1.1.4 DNA 电化学生物传感器  15-16
    1.1.5 探针及其固定  16
    1.1.6 电活性指示剂和标记物  16
    1.1.7 DNA 电化学生物传感器的应用  16-18
  1.2 离子液体简介  18-20
  1.3 纳米粒子在DNA 生物传感器中的应用  20-24
    1.3.1 纳米材料简介  20
    1.3.2 纳米粒子的特点  20-21
    1.3.3 纳米金在DNA 生物传感器研究中的应用  21-24
  1.4 DNA 生物传感器的应用与展望  24-25
    1.4.1 DNA 电化学生物传感器的应用  24
    1.4.2 DNA 电化学生物传感器的前景展望  24-25
  1.5 立题依据及研究内容  25-26
第二章 丝网印刷电极的构建  26-40
  2.1 实验部分  27-30
    2.1.1 仪器与试剂  27-28
    2.1.2 电化学检测  28
    2.1.3 聚苯胺纳米管的合成  28
    2.1.4 纳米金胶的制备及与电极的结合  28-29
    2.1.5 丝网印刷电极的制备  29-30
  2.2 结果与讨论  30-33
    2.2.1 樟脑磺酸掺杂的聚苯胺纳米管  30-31
    2.2.2 制备金纳米粒子的透射电镜表征  31
    2.2.3 丝网印刷电极表面的扫描电子显微镜图  31-33
  2.3 修饰电极最佳条件的探讨  33-39
    2.3.1 离子液体种类的选择及最佳掺入比例的探讨  33-35
    2.3.2 聚苯胺纳米管作用及影响  35-36
    2.3.3 壳聚糖的作用及影响  36-37
    2.3.4 修饰电极构建过程的表征  37-39
  2.4 小结  39-40
第三章 酶做指示剂的丝网印刷电极对DNA的检测  40-53
  3.1 实验部分  40-44
    3.1.1 仪器与试剂  40-41
    3.1.2 电化学检测  41
    3.1.3 邻苯二胺与双氧水反应缓冲液的最优pH 值和电化学检测支持电解质的pH 值选择  41-42
    3.1.4 邻苯二胺与双氧水反应缓冲液和电化学检测支持电解质的种类选择  42
    3.1.5 HRP 催化邻苯二胺与双氧水反应的最佳时间  42
    3.1.6 双氧水和邻苯二胺的最佳浓度  42
    3.1.7 靶DNA 的固定和杂交  42-44
  3.2 结果与讨论  44-51
    3.2.1 HRP 催化邻苯二胺与双氧水反应的最佳缓冲液与检测支持电解质最佳pH值的选择  44-45
    3.2.2 邻苯二胺与双氧水反应缓冲液和电化学检测支持电解质的种类选择  45-46
    3.2.3 HRP 催化邻苯二胺与双氧水的反应时间  46-47
    3.2.4 邻苯二胺与双氧水的浓度的选择  47-48
    3.2.5 不同浓度DNA 的检测及灵敏度  48-50
    3.2.6 丝网印刷传感器的选择性  50-51
  3.3 小结  51-53
第四章 以六氨基钌为指示剂的基于壳聚糖聚苯胺纳米管离子液体修饰的丝网印刷 DNA 传感器的研究  53-62
  4.1 实验部分  54-57
    4.1.1 仪器与试剂  54
    4.1.2 电化学检测  54-55
    4.1.3 丝网印刷电极的制备  55
    4.1.4 电化学还原法制备纳米金并同时沉积  55
    4.1.5 纳米金胶SH-DNA 结合  55
    4.1.6 靶DNA 的固定和杂交  55-57
  4.2 结果与讨论  57-61
    4.2.1 电化学还原法制备纳米金并同时沉积结果讨论  57
    4.2.2 纳米金胶、纳米金胶与SH-DNA 结合、SH-DNA 的紫外可见光谱  57-58
    4.2.3 不同浓度DNA 的检测及灵敏度  58-60
    4.2.4 丝网印刷传感器的选择性  60-61
  4.3 小结  61-62
第五章 DNA 循环复制与肿瘤细胞检测  62-79
  5.1 实验部分  62-66
    5.1.1 仪器与试剂  62-63
    5.1.2 电化学检测  63
    5.1.3 靶DNA 的固定和杂交  63-64
    5.1.4 靶DNA 的固定、杂交、循环复制  64
    5.1.5 磁珠与适体DNA 序列结合  64
    5.1.6 适体DNA 序列与信使序列杂交  64
    5.1.7 适体DNA序列与Ramos肿瘤细胞结合  64-65
    5.1.8 DNA 复制条件探讨  65-66
  5.2 结果与讨论  66-77
    5.2.1 不同浓度DNA 的检测及灵敏度  66-68
    5.2.2 丝网印刷传感器的选择性  68-69
    5.2.3 DNA 复制前后嵌插邻菲啰啉钴结果讨论  69-70
    5.2.4 加入复制酶循环复制时间探讨  70
    5.2.5 加入复制酶循环复制酶的用量探讨  70-71
    5.2.6 复制过程的电化学阻抗结果分析  71-72
    5.2.7 靶DNA 的固定和杂交  72-74
    5.2.8 丝网印刷传感器的选择性  74
    5.2.9 细胞适体与磁珠作用时间探讨  74-75
    5.2.10 不同浓度细胞的检测及灵敏度  75-77
    5.2.11 丝网印刷传感器的选择性  77
  5.3 小结  77-79
参考文献  79-85
结论  85-87
致谢  87-88
攻读学期间发表的学术论文目录  88-89

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中图分类: > 工业技术 > 自动化技术、计算机技术 > 自动化技术及设备 > 自动化元件、部件 > 发送器(变换器)、传感器 > 生物传感器、医学传感器
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