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清肝化淤方剂肝癌患者含药血清对人肝癌SMMC-7721细胞作用的基因芯片分析

作　者: 贺云妹
导　师: 殷飞
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 清肝化瘀方剂血清预处理原发性肝癌丙酮基因芯片
分类号: R285.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,死亡率占第二位。中医中药在肝癌的治疗中有重要作用。姚树坤教授根据中医传统理论和近十年的临床研究,以清热解毒、破瘀散结、健脾益气为治法,针对大多数患者的中医证型,研制成清肝化瘀方剂,从临床和基础实验证实对肝癌前病变及癌变有明显的阻断作用。从癌基因、抑癌基因、细胞凋亡、细胞周期和免疫机制等多角度综合研究清肝化瘀方剂的作用机理,表明清肝化瘀方剂多环节、多靶点分子网络的作用机理,丰富与完善了中药抗癌研究的理论体系。血清药理学的研究方法是中药复方体外实验新兴的一种方法,由于它同用中药粗制剂直接进行的体外实验相比,既具有体外实验条件可控性强、药物效应易于检测、可深入揭示药物作用机理的优点,是近年来中药药效学研究的重要方法。基因芯片技术可以在全基因组范围内同时分析待测样本中成千上万个基因的表达情况及其相互关系,揭示基因网络的相互作用,具有快速、平行、高效、高通量地分析生物信息的特点。在中药的研究中是一种可以揭示其多环节、多靶点分子网络作用机制的可信的、新兴的试验方法。本实验采用血清药理学与基因芯片技术相结合的方法,通过基因芯片上的32050个探针组检测了人肝癌SMMC-7721细胞经过未服药肝癌患者血清、服用清肝化瘀方剂6周的肝癌患者含药血清分别经过加热法和丙酮处理法处理后培养48小时后全基因组基因的表达差异,寻找参与清肝化淤方剂抗肿瘤作用的基因,在基因组学水平探讨中药抗肿瘤的作用机制。方法:1细胞株及细胞培养。体外培养肝癌细胞株SMMC-7721,SMMC-7721细胞贴壁生长于含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100mg/ml的DMEM培养液中,置于37°C,5% CO2培养箱中培养。3～4天传代一次,取对数生长期的细胞用于实验。2肝癌患者血清的预处理。将服药前肝癌患者血清及口服清肝化淤方剂6周的肝癌患者含药血清分别用以下方法处理: (1)加热法:血清置于56 oC水浴30min;(2)丙酮法:血清加4倍体积的丙酮混匀,3000rpm,离心10min,取上清液置于37 oC恒温水浴箱蒸发,除去丙酮。3用经过预处理的血清培养人肝癌细胞株SMMC-7721并抽提RNA。将服药前和服药后6周的患者血清分别应用加热法和丙酮法进行预处理并加入培养瓶,使其浓度为15%。培养48小时后,弃培养液,PBS液冲洗两遍,应用0.25%胰酶消化,用含10%小牛血清的DMEM培养液终止消化,加PBS液吹打成细胞悬液,移入无RNase的EP管离心,弃上清,冰盒预冷,每支EP加入TRIZOL试剂1ml,吹打数次,封口,标记,-70oC保存备用。4将提取的细胞RNA,进行Phalanx人表达谱芯片分析,基因芯片杂交步骤按照上海康成实验室表达谱芯片实验操作流程进行,并进行数据处理和分析。结果:1差异表达的基因。(1)丙酮处理与加热处理相比:服药前血清培养的细胞差异表达的基因有3250个,其中上调2倍及2倍以上的有1555个,占基因总数的4.85%;表达下调2及2倍以上的有1695个,占基因总数的5.29%。服药后6周血清培养的细胞异表达的基因有2823个,其中上调2倍及2倍以上的有1395个,占基因总数的4.35%;表达下调2倍及2倍以上的有1428个,占基因总数的4.46%。(2)用药后6周血清与用药前血清相比:经过加热处理培养的细胞差异表达的基因有2880个,其中上调2倍及2倍以上的有1487个,占基因总数的4.64%;表达下调2倍及2倍以上的有1393个,占基因总数的4.35%。经过丙酮处培养的细胞差异表达的基因有2314个,其中上调2倍及2倍以上的有1128个,占基因总数的3.52%;表达下调2倍及2倍以上的有1186个,占基因总数的3.70%。2差异基因的功能分类:服药后血清经过丙酮处理与加热处理相比,上调的基因主要与细胞周期、细胞凋亡、信号传导途径有关。下调的基因主要与物质代谢、细胞增殖有关。加热处理的服药后血清与服药前血清相比,上调的基因主要与细胞周期、细胞凋亡、抑癌基因、信号转导、免疫功能有关。下调的基因主要与癌基因、细胞增殖、物质和能量代谢、细胞生长有关。3服药后6周血清与服药前血清相比,显著上调的基因有PDCD8、TGFB1、MAP4K3、BTG1、CDKN3、OVOL1等,显著下调的基因有IRAK2、RHOA、DEAF1、IGFBP2、BAD等,主要与细胞增殖、信号转导通路、细胞凋亡、抑癌基因有关。结论:1清肝化瘀方剂肝癌患者服药6周的含药血清,可影响人肝癌SMMC-7721细胞的基因表达,主要通过调节与信号转导、细胞增殖、抑癌基因、细胞凋亡、物质和能量代谢、细胞生长相关的基因,如OVOL1,BTG1,CDNK3等,从多靶点发挥对肿瘤细胞生长的抑制作用。这些基因的作用需进一步验证。2肝癌患者含药血清应用加热进行预处理与应用丙酮预处理相比,差异表达的基因数目相对多,对抑制细胞生长等相关功能基因的表达影响更明显。可能与丙酮使血清中药物成分减少有关。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
研究论文清肝化淤方剂肝癌患者含药血清对人肝癌SMMC-7721细胞作用的基因芯片分析  11-43
  前言  11-12
  材料与方法  12-22
  结果  22-24
  附图  24-27
  附表  27-32
  讨论  32-37
  结论  37-38
  参考文献  38-43
综述基因芯片技术在肝病中的应用进展  43-52
致谢  52-53
个人简历  53

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