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Conantokins抑制小鼠吗啡依赖功能的发现及机理的初步研究

作　者: 于正
导　师: 戴秋云
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: NMDA受体 conantokins 吗啡依赖 抑制 机理
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


Conantokins (Con-)是芋螺活性肽的一个重要家族,能特异性作用于N-甲基-天门冬氨酸受体(NMDAR)及其亚型,是目前发现的该受体的唯一一类多肽抑制剂。NMDA受体NR2B亚基与镇痛、神经保护、戒毒等密切相关,NR2B亚基特异抑制剂对研发低副作用的镇痛、神经保护、戒毒药具有诱人前景。前期本实验室发现con-G及其突变体对吗啡依赖小鼠的催促戒断跳跃具有显著抑制作用,且抑制活性与其对NR2B亚基的选择性密切相关,但该类抑制剂对小鼠吗啡精神依赖没有研究。本论文在前期工作基础上,开展了对NMDA受体NR2B亚基选择性抑制剂Conantokins的进一步筛选并初步研究了其抑制吗啡身体依赖发展、精神依赖发展、表达的新功能的作用机理,获得了如下新结果：(1)筛选了21个conantokins天然肽及其突变体,找到了一种副作用低且特异性作用于NMDA受体NR2B亚基的抑制剂con-T-[M8Q],不仅能有效抑制小鼠的吗啡身体依赖的表达与发展,而且不影响小鼠的运动功能及自发活动。(2) Con-T-[M8Q]对小鼠的吗啡精神依赖的表达与发展具有显著抑制作用,5nmol/kg的剂量con-T[M8Q]几乎能完全抑制小鼠吗啡精神依赖的表达及发展。(3)研究了吗啡依赖小鼠在给不同剂量con-T-[M8Q]抑制剂后主要相关信号通路的变化,结果表明：Con-T[M8Q]能够抑制吗啡依赖小鼠NMDA受体NR2B亚基1472位酪氨酸的磷酸化水平,下调非磷酸化NR2B亚基的表达水平；除CaMKI mRNA的表达量和抑制剂剂量之间没有明显规律性变化外,CaMKIIa、β单体及CaMKIV mRNA的表达量均随抑制剂剂量的增高而降低；Con-T[M8Q]同时还下调ERK、c-fos蛋白的表达水平。该工作为吗啡依赖相关机理研究提供了一个很好的研究工具,并为相关抑制剂的应用提供了机理支持。

全文目录


缩略词表  7-8
摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
第一章 前言  11-21
  1.1 NMDA受体概述  11-15
    1.1.1 NMDA受体在药物依赖形成中的作用  12-14
    1.1.2 NMDA受体抑制剂研究进展  14-15
  1.2 Conantokins研究进展  15-18
    1.2.1 Conantokins概述  15-16
    1.2.2 Conantokins的作用靶点  16
    1.2.3 Conantokins结构与功能的关系  16-18
    1.2.4 Conantokins的药理作用  18
  1.3 本课题的设计思路与方法  18-21
第二章 Conantokins抑制小鼠吗啡依赖活性的筛选及评价  21-37
  2.1 前言  21-22
  2.2 实验材料  22-23
  2.3 试验方法  23-24
    2.3.1 Conantokins突变体抑制吗啡依赖小鼠催促戒断跳跃活性的测定  23
    2.3.2 Conantokins突变体抑制小鼠吗啡身体依赖发展活性的测定  23
    2.3.3 Con-G[S16Y]、con-R[1-17]和con-T[M8Q]对小鼠运动功能的影响  23
    2.3.4 Con-T[M8Q]对小鼠自发活动的影响  23
    2.3.5 Con-T[M8Q]对小鼠吗啡精神依赖的抑制活性的测定  23-24
    2.3.6 Con-T[M8Q]对小鼠吗啡精神依赖发展的抑制作用  24
    2.3.7 实验结果统计  24
  2.4 实验结果  24-34
    2.4.1 Conantokins各突变体抑制吗啡身体依赖小鼠戒断跳跃的活性  24-28
    2.4.2 Conantokins各突变体对小鼠吗啡身体依赖发展的抑制作用  28-30
    2.4.3 Con-G[S16Y]、Con-R[1-17]和Con-T[M8Q]对小鼠运动功能的影响  30-31
    2.4.4 Con-T[M8Q]对小鼠自发活动的影响  31-32
    2.4.5 Con-T[M8Q]对小鼠吗啡精神依赖的抑制作用  32-33
    2.4.6 Con-T[M8Q]对小鼠吗啡精神依赖发展的抑制作用  33-34
  2.5 讨论  34-35
  2.6 小结  35-37
第三章 ConT-[M8Q]抑制小鼠吗啡依赖机理的初步研究  37-51
  3.1 前言  37
  3.2 实验材料  37-39
    3.2.1 实验仪器、材料  37-38
    3.2.2 主要试剂及配制方法  38-39
  3.3 试验方法  39-43
    3.3.1 吗啡依赖小鼠脑海马组织RNA的提取  39
    3.3.2 吗啡依赖小鼠脑组织RNA的反转录  39
    3.3.3 CaMKⅠγ、CaMKⅡa、β、d及CaMKⅣ基因的扩增  39-41
    3.3.4 钙调蛋白激酶单体mRNA表达量的Real-time PCR半定量分析  41
    3.3.5 吗啡依赖小鼠脑组织海马区蛋白的提取及定量  41-42
    3.3.6 Western-blot实验  42-43
    3.3.7 免疫组织荧光实验  43
  3.4 实验结果  43-49
    3.4.1 Con-T[M8Q]作用后吗啡依赖小鼠脑组织海马RNA的提取及定量  43
    3.4.2 CaMKⅠγ、CaMKⅡa、β、d及CaMKⅣ基因的扩增  43-44
    3.4.3 几种钙调蛋白激酶单体mRNA表达量的半定量分析结果  44-45
    3.4.4 吗啡依赖小鼠脑组织海马区蛋白的提取及定量  45
    3.4.5 Con-T[M8Q]对吗啡依赖小鼠海马区CaMKⅡa、β表达的影响  45
    3.4.6 Con-T[M8Q]对吗啡依赖小鼠海马区CaMKⅣ蛋白表达的影响  45-46
    3.4.7 Con-T[M8Q]对NR2B亚基1472位Try磷酸化水平的影响  46-48
    3.4.8 Con-T[M8Q]对吗啡依赖小鼠脑组织内pERK及c-Fos表达的影响  48-49
  3.5 讨论  49-50
  3.6 小结  50-51
结论  51-52
参考文献  52-59
致谢  59-60
附录(一) 硕士期间完成的其它工作-部分抗凝血肽的合成及功能研究  60-88
  摘要  63-65
  1 前言  65-66
  2 实验材料和仪器  66-68
    2.1 实验仪器  66-67
    2.2 主要试剂  67
    2.3 实验动物  67-68
    2.4 主要试剂及配制方法  68
  3 试验方法  68-71
    3.1 多肽固相合成  68
    3.2 HIR-GKGG-HV3抑制大鼠体内静脉血栓形成实验  68-69
    3.3 HIR-GKGG-HV3抑制大鼠体内动脉血栓形成实验  69
    3.4 生色底物法测定HIR-GKGG-HV3抗凝血酶分解时间  69
    3.5 荧光光谱法测定HIR-GKGG-HV3和人血清白蛋白的结合情况  69
    3.6 HIR-GKGG-HV3抗胰酶分解能力的测定  69-70
    3.7 凝血酶滴定实验  70
    3.8 抗血小板凝集实验  70
    3.9 出血风险评价实验  70
    3.10 实验结果统计分析  70-71
  4 实验结果  71-81
    4.1 多肽的合成及分析  71-72
    4.2 HIR-GKGG-HV3体内抑制静脉血栓形成实验  72-73
    4.3 HIR-GKGG-HV3抑制大鼠体内动脉血栓形成的测定  73
    4.4 HIR-GKGG-HV3出血风险评价实验  73-74
    4.5 生色底物法测定HIR-GKGG-HV3抗凝血酶分解时间  74-75
    4.6 荧光光谱法测定HIR-GKGG-HV3和HSA的结合情况  75-76
    4.7 HIR-GKGG-HV3抗胰酶分解能力的测定  76-79
    4.8 新型抗凝肽对凝血酶的抑制活性  79-80
    4.9 新型抗凝肽抑制ADP-诱导的血小板凝集的活性  80-81
    4.10 出血风险评价实验  81
  5 讨论  81-82
  6 总结  82-84
  参考文献  84-87
  致谢  87-88
附录(二) 硕士期间发表的论文及申请的专利目录  88-90
附录(三) 硕士期间发表的科研论文  90-98
个人简历  98

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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