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胰高血糖素样肽-1对正常人肝细胞作用机制的研究-PI3K通路

作　者: 沈芳芳
导　师: 谢云
学　校: 天津医科大学
专　业: 内科学
关键词: 胰高血糖素样肽-1 正常人肝细胞 糖原合成酶 磷酸化糖原合成酶 磷脂酰肌醇-3激酶
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：1.体外培养正常人肝细胞L02系。2.研究胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)对正常人肝细胞的作用机制-PI3K通路。3.为GLP-1有效的降糖、降低体重以及改善胰岛素抵抗等临床治疗提供初步的理论依据。方法：1.体外培养正常人肝细胞L02系,通过倒置显微镜形态学观察。2.将培养的正常人肝细胞随机分为7组：Ctrl组,GLP-1(10nmol/l)组,GLP-1(1nmol/l)组,INS组(10nmol/1),INS组(1 nmol/l), GLP-1 (10nmol/l)+INS(10nmol/1)组,GLP-1(1nmol/l)+INS (1nmol/l)组,分别干预48小时。观察各组细胞的形态学变化,并用MTT法检测GLP-1、INS对正常人肝细胞存活数量和活力的影响,观察两种不同浓度的GLP-1与INS对人肝细胞的生长促进作用的差别。3.将培养的正常人肝细胞随机分为6组：Ctrl组,GLP-1(10nmol/l)组,INS组(10nmol/l), LY294002(15μmol/l)组,GLP-1(10nmol/1)+LY294002(15μmol/1)组,GLP-1 (10nmol/l)+INS (10nmol/l)组,分别干预24小时后,用蛋白质印迹(western blot)法测定各组总糖原合成酶(GS)、磷酸化糖原合成酶(P-GS)的表达,并计算糖原合成酶的活性。结果：1.正常人肝细胞L02的传代培养情况良好。2.GLP-1组、INS组、GLP-1+INS组肝细胞与Ctrl组相比细胞形态未有明显改变,但可见GLP组、INS组、GLP-1+INS组肝细胞的生长速度较快。MTT结果表明：与Ctrl组相比,GLP-1组、INS组、GLP-1+INS组的OD值均明显增高(P<0.05),表明GLP-1、INS单独以及联合应用均使细胞存活数量及活力增加,促进人肝细胞的生长。与GLP-1+INS相比,GLP-1组、INS组单独应用的OD值较低(P<0.05),表明GLP-1和INS联合应用对人肝细胞生长具有叠加作用。各干预组两种浓度10nmol/1与1 nmol/1对人肝细胞的生长促进作用没有明显差别,故以下的试验步骤GLP-1和INS使用的终浓度均设为10nmol/1。3.western blot结果表明,GLP-1、INS均能增加人肝细胞总GS的表达量,降低失活状态的P-GS的表达量,提高GS的活性,并且GLP-1和INS联合应用对人肝细胞GS的影响有叠加作用。PI3K阻断剂LY294002在一定程度上阻断了GLP-1促进人肝细胞总GS的表达、抑制P-GS的表达以及提高GS活性的作用。(1)与Ctrl组相比,GLP-1组、INS组、GLP-1+INS组的总GS的表达量均明显增加(P<0.05),表明GLP-1、INS单独及联合应用均促进人肝细胞总GS的表达;与GLP-1+INS组相比,GLP-1组、INS组单独应用时总GS的表达量较低(P<0.05),表明GLP-1和INS联合应用对人肝细胞总GS的表达量的促进作用具有叠加效应。与GLP-1组相比,GLP-1+LY294002组的总GS的表达量明显减少(P<0.05),表明PI3K的阻断剂LY294002阻断了GLP-1促进人肝细胞总GS的表达的作用。(2)与Ctrl组相比,GLP-1组、INS组、GLP-1+INS组的P-GS的表达量均明显降低(P<0.05),表明GLP-1、INS单独及联合应用均降低人肝细胞P-GS的表达；与GLP-1+INS组相比,GLP-1组、INS组单独应用时P-GS的表达量较高(P<0.05),表明GLP-1和INS联合应用对人肝细胞P-GS的表达量的抑制作用具有叠加效应。与GLP-1组相比,GLP-1+LY294002组人肝细胞的P-GS的表达量明显增加(P<0.05),表明PI3K阻断剂LY294002在一定程度上阻断了GLP-1抑制P-GS的表达的作用。(3)用P-GS/GS的比值来表示GS的活性,比值越大,GS的活性越低。结果显示,与Ctrl组相比,GLP-1组、INS组、GLP-1+INS组GS的活性均明显提高(P<0.05)；与GLP-1+INS组相比,GLP-1组、INS组单独应用时GS的活性较低(P<0.05),表明GLP-1和INS联合应用对提高人肝细胞GS活性的作用具有叠加效应。与GLP-1组相比,GLP-1+LY294002组的GS的活性明显降低(P<0.05)。结论：本研究通过体外试验验证了GLP-1可直接作用于人肝细胞,促进肝细胞的生长。试验结果也证实了GLP-1通过增加人肝细胞总GS的表达量,降低失活状态的P-GS的表达量,从而使活性状态的去磷酸化GS的表达量增加,来提高GS的活性,促进人肝细胞的糖原合成。在GLP-1干预的同时给予PI3K阻断剂LY294002后,人肝细胞总GS的表达量下降,而失活状态的P-GS的表达量增加,活性状态的去磷酸化GS的表达量减少,使得GS的活性降低,降低了GLP-1促进人肝细胞糖原合成的作用。由此可知,GLP-1诱导人肝细胞糖原合成增加的作用可能是通过激活PI3K通路,使结合在细胞膜上的PKB/AKT脱落进入胞质,下调GSK-3的活性,进而提高信号转导通路下游GS的活性,促进人肝细胞的糖原合成。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-10
符号说明  10-11
前言  11-13
  研究现状、成果  11-12
  研究目的、方法  12-13
对象和方法  13-27
结果  27-33
讨论  33-41
结论  41-42
参考文献  42-47
发表论文和参加科研情况说明  47-48
综述  48-58
  胰高血糖素样肽-1的胰腺外作用的研究进展  48-54
  综述参考文献  54-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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