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大鼠脑缺血VEGF与NG2细胞增殖关系的初步研究

作　者: 焦岩
导　师: 陈康宁
学　校: 第三军医大学
专　业: 神经病学
关键词: 颈动脉狭窄少突胶质前体细胞血管内皮生长因子脑缺血
分类号: R743
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景近年来发现血管内皮细胞生长因子( vascular ep thelial growth factor, VEGF)具有神经保护的功能,还可促进受损神经细胞的存活和成年哺乳动物神经细胞再生,能减轻脑损伤、用于治疗缺血性脑血管疾病[1]。在神经系统发育过程中,VEGF主要表达于神经外胚层的脑室周边区,该区的VEGF呈梯度表达,内层最高,由内而外逐渐降低。表达VEGF的细胞有神经母细胞、神经胶质细胞和血管内皮细胞,其中以分化中的神经母细胞表达水平最高。随着中枢神经系统发育成熟,VEGF的表达逐渐减少。VEGF在正常成人和动物组织中表达水平较低。缺血损伤后,脑内VEGF的表达水平显著上调[2]一般认为,缺血诱导表达VEGF的细胞主要为位于周边区的神经元、胶质细胞和血管内皮细胞[3]。Jin年研究发现VEGF对神经组织有直接保护作用,有助于延长细胞的存活时间直到新血管形成。这一保护机制由KDR介导完成[3],使皮质神经元免受低氧和糖缺乏的损害。同时体内外实验证实,通过KDR介导VEGF可以促进神经元前体细胞的增殖[4]。在胚胎发育期,VEGF具有诱导新生血管形成和神经细胞生成(neumgenesis)的作用,对神经组织的生长发育具有重要意义。而当中枢神经在遭受缺血缺氧等打击后,VEGF又可诱导神经干细胞增殖和迁徙,促进中枢神经损伤的修复。在神经前体细胞培养液中加入VEGF可使细胞数量增加20%—30%,采用微泵技术将VEGF持续注入大鼠侧脑室内,4 d后海马Brdu标记阳性细胞明显增加,提示VEGF具有促进神经干细胞增殖的作用[4]。少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells OPCs)是最近发现的一种在成年哺乳动物大脑灰质和白质中广泛存在的胶质细胞, NG2是表达在OPC细胞膜上的一种硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitinsulp hate peoteoglycan ,CSPG),可以作为OPC的特异性细胞标志物[5]。在培养细胞系统,已经发现OPC有分化成多种细胞的潜能,它能够分化成少突胶质细胞和星形胶质细胞[6],甚至还能分化成神经元[7]。NG2细胞在大鼠的胚胎期就出现表达,随着胚胎的发育成熟,NG2细胞表达逐渐增多,在出生时达到最高。虽然髓鞘化在大鼠出生后1月就已经基本完成,但NG2表达阳性的细胞仍然大量存在。成年的N G2阳性细胞在中枢神经系统中占所有胶质细胞比例的5 %～8 %,且在灰质和白质数目略有区别,白质区占8 %～9 %。灰质区占2 %～3 %[5],在皮层和海马区域其和少突胶质细胞的比例为1∶1。除数目不一致外,灰质和白质区的NG2阳性细胞也表现出不同的形态,[8]在灰质区细胞胞体呈圆形或椭圆形,有许多的突起呈放射状从胞体发出;在白质,它们被髓鞘化的轴突挤在了局限的区域里,使得胞体呈长条形或梭形,其突起也呈两极发放状态,并与轴突平行。当出现脑缺血损伤时,损伤周围的NG2阳性细胞出现形态学改变,胞体扩大,突起也变得肥厚,NG2的免疫反应性明显增强。NG2阳性细胞是对中枢神经系统损伤迅速作出反应的细胞类型之一,但是NG2阳性细胞在正常中枢神经系统的功能还不是很清楚。除针刺和脊髓半切伤外,缺血、兴奋性中毒实验诱导的脱髓鞘等中均可出现NG2阳性细胞增殖反应[9]。同样该细胞在成熟大脑中的作用以及损伤和修复状态下被激活的意义还不是很确定。目前的研究表明,中枢神经系统损伤后反应的主要特点就是NG2阳性细胞的快速增殖,但是促进这种细胞增殖的信号尚不明了。但是因为这种反应只出现在损伤区域,无论什么机制促使NG2阳性细胞快速再进入细胞周期,都必须控制在损伤局部。一种可能性就是临近的神经元或少突胶质细胞可能是通过Notch信号通路保持NG2阳性细胞的正常缓慢增殖[10]。而血管内皮生长因子VEGF除了具有促进内皮细胞和血管平滑肌细胞增殖的作用,可用于缺血性血管疾病的治疗外,新近的研究发现,VEGF还是一种十分重要的神经营养因子和保护因子,神经元和星形胶质细胞表面均分布有VEGF的受体,而且神经细胞自身也具有合成VEGF的功能.它参与了Notch信号通路的调节[11]。那么,在脑部缺血后,VEGF是否参与了促进NG2细胞增殖再生的过程,未见相关文献报道。目的:观察大鼠脑缺血后少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells, OPCs)的表达,并初步探讨血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)在其中的作用。方法:5～6月龄健康SD大鼠78只雌雄各半,体质量280～300g。实验动物按随机数字表法分为3组:假手术非缺血对照组(简称对照组)、缺血组及缺血+贝伐单抗组,脑缺血的模型制作采用改良的双侧颈动脉狭窄模型。每组设缺血6、12、24、72h 4个时相点,每个时相点6只大鼠。免疫荧光双标NG2、VEGF细胞的变化。另每组任取2只行DSA造影。主要结果:1.颈动脉狭窄脑部缺血后,在大脑皮质VEGF阳性细胞随脑缺血时间延长开始出现增殖,24h达到高峰,随后72h出现下降。在缺血6h达(23.33±3.93),明显高于假手术组(3.17±0.75)(p<0.01);在缺血24h达到高峰(57±3.58),较6h明显增多(p<0.05)。72h(46.67±2.16)较24h(57±3.58)有所下降(p<0.05)。2.颈动脉狭窄脑缺血后,在大脑皮质NG2阳性细胞随脑缺血时间延长出现增殖,在缺血6h达(6.50±1.05),明显高于假手术组(2.83±0.31)(p<0.01);随着缺血时间延长,NG2细胞进一步增加,到缺血72h达到(17.67±2.73)(p<0.05)。3.在大脑皮层区NG2阳性呈红色,VEGF阳性细胞呈绿色,双阳性的细胞呈黄绿色。二者基本完全重叠。4.颈动脉狭窄脑缺血后, NG2和VEGF双阳性细胞数细胞明显增多,在缺血后6h达(5.50±1.05),明显高于假手术组(2.83±0.31)(p<0.01);随着缺血时间的延长,NG2和VEGF双阳性细胞数进一步增加,到缺血后72h达高峰(17.83±2.99),较6h组双阳性细胞有明显增多(p<0.05),缺血各时限组NG2和VEGF双阳性细胞均高于假手术组(p<0.01)。5.颈动脉狭窄脑缺血后缺血+贝伐单抗组在6hNG2和VEGF双阳性细胞数细胞达(4.33±1.21) ,低于缺血组6h(5.50±1.05)(p<0.05)高于假手术组6h(2.83±0.31)(p<0.01),以后各时相点的双阳性细胞数均低于缺血组(p<0.05),高于假手术组(p<0.01)。结论1.改良的双侧颈动脉狭窄模型能较好的模拟脑缺血的病理生理过程。该模型具有稳定、简单的特点;2.脑缺血诱导可以诱导NG2细胞的增殖、促进VEGF表达;脑缺血诱导可以诱导NG2细胞的增殖机理可能与脑缺血诱导的VEGF表达增加有关。

全文目录

英文缩写一览表  4-5
英文摘要  5-9
中文摘要  9-12
论文正文大鼠脑缺血VEGF 与NG2 细胞增殖关系的初步研究  12-47
  前言  12-16
  材料和方法  16-21
  结果  21-27
  讨论  27-33
  结论  33-34
  图片  34-41
  致谢  41-42
  参考文献  42-47
文献综述少突胶质细胞前体细胞及其在中枢神经系统中的作用  47-56
  参考文献  53-56
攻读研究生期间发表的论文  56

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