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重组人骨形成蛋白-2结合胶原骨粉/无胶原骨粉在兔股骨远端标准骨缺损模型中成骨效能的研究

作　者: 韦从云
导　师: 周磊
学　校: 南方医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 兔股骨骨组织替代材料实验动物模型动物实验骨形成蛋白
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景：外伤、肿瘤、感染等因素导致大量的骨缺损,骨缺损的修复与重建依然是临床难题。自体骨移植由于同时具备骨生成、骨诱导、骨传导、可吸收、可重建特性,被认为是最好的骨移植材料,但由于供骨量有限,供区发病等缺陷而限制了其临床应用,促使人们寻找可以取代自体骨的骨组织替代材料,骨组织替代材料的研究开发成为目前骨组织工程研究重点关注的内容。骨组织工程材料首先要考虑其骨诱导性和骨引导性。骨诱导性是指移植骨能诱导宿主间充质细胞聚集并分化为成骨细胞形成新骨；骨引导性是指移植骨能提供支架结构引导血管和成骨细胞长入移植骨形成新骨。目前多数骨组织替代材料仅具有骨引导特性,临床使用时常限于较小的骨缺损。牛骨是目前研究和应用最广泛的异种骨材料,有骨引导作用,但无骨生成作用及骨诱导作用,其主要成分是羟基磷灰石。具有诱导成骨作用的物质包括骨形成蛋白等被认为是替代自体骨移植最有前途的替代物。随着基因工程的发展,目前已研制出活性好、成本低的rhBMP-2,使BMP-2的来源得到了初步解决。rhBMP-2单独使用时易分散和降解,成骨效能低,使用时需要与载体结合。在骨组织工程中,目前亟待解决的问题是如何选择理想的生物活性材料及其载体,因为只有具备高度成骨能力的生物活性材料和良好缓释功能的载体以一定方式相结合才能最大限度地发挥各自的功能,有效地促进骨生长。大量的载体被研究开发,胶原是骨组织的基本成分,由于它的功能多样性,良好的生物相容性及较低的免疫原性,被认为是BMP最理想的载体之一。研究表明,单独胶原的成骨能力是有限的。本实验所用rhBMP-2结合胶原骨粉,是把含七个氨基酸的寡肽即胶原结合域和rhBMP-2的N端结合,实现rhBMP-2与胶原的紧密结合,从而固定在带胶原小牛骨上。胶原与rhBMP复合保护rhBMP不至扩散太快,使rhBMP在较长时间内在局部保持较高浓度而发挥骨诱导作用,以促进rhBMP活性的发挥。我们实验组在前期工作中,已进行了低剂量的rhBMP-2结合胶原骨粉在兔胫骨干骺端中成骨效能的实验研究。研究发现,rhBMP-2结合胶原骨粉早期成骨能力强但降解过快,无胶原骨粉为新骨的进一步形成提供良好支架,但无胶原骨粉降解缓慢。将二者的优点结合起来为开发新的良好的骨移植材料提供了可能。我们选择了不同比例的rhBMP-2结合胶原骨粉/无胶原骨粉混合,希望骨改建早期充分利用rhBMP-2结合胶原骨粉早期诱导成骨的作用,后期通过的尚未降解完全的无胶原骨提供的支架继续完成骨改建,并利用其不同的降解特性,改变组分的配比,而能得到降解速率可调兼具有骨引导和骨诱导活性的双重成骨作用的新型理想骨移植材料。为充分了解骨组织替代材料生物学性能及实验结果的可靠性,建立合适的骨缺损动物模型是研究骨组织替代材料的前提。但很少有研究者对实验动物模型给予充分关注。骨组织替代材料在不同的动物模型及解剖部位成骨情况是不同的。本实验通过对兔股骨远端干骺端解剖结构的分析,以及对骨组织替代材料在该骨缺损模型中的应用观察,探讨该标准承重骨缺损动物模型的优点和可行性,为理想骨缺损动物模型带来新的思路。目的：1.探讨兔股骨远端标准骨缺损动物模型的优点及在骨组织替代材料研究应用的可行性及科学性,为组织工程理想动物模型提供新的思路2.研究重组人骨形成蛋白-2与胶原结合后对成骨效能的影响3.初步探讨具有骨引导和骨诱导活性的新型骨移植材料的成骨效能方法：1.实验动物及分组(1)第一部分实验15只成年健康新西兰大白兔,随机分为2组。实验组12只动物,观测时间为2、4、6、12周,每组每个时间段各3只动物6个标本,观察骨组织替代材料在各时间段的成骨效能及降解情况。对照空白组3只动物6个标本,观察12周时骨缺损愈合情况。(2)第二部分实验72只成年健康新西兰大白兔,随机分为6组：A、B、C、D、E、F,每组有12只动物24个标本。A组植入植入无胶原骨粉；B组植入植入胶原骨粉；C组植入游离rhBMP-2胶原骨粉；D组植入rhBMP-2结合胶原骨粉；E组植入rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉；F组植入rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：3均匀混合骨粉。2.手术过程及实验动物模型的建立所有动物均选双侧股骨远端干骺端施术,建立直径6mm,深度10mm的骨缺损,按分组分别植入相应的骨组织替代材料。3.主要检测分析方法通过大体观察,放射线观察,股骨远端干骺端解剖学测量及组织学切片观察新生骨形成情况及骨缺损愈合情况,采用SPSS13.0对各时间段相关实验数据进行统计学分析。结果：1.实验动物术后生长恢复良好,无死亡动物,未见病理性骨折。按照实验分组在各时间段每组各时间段处死3只动物,各得6个标本。2.标本大体观察可初步评价骨组织替代材料修复降解能力及骨缺损区愈合情况。根据放射影像密度的不同时点表现,可以对比骨组织替代材料降解吸收情况及骨缺损愈合情况,同时可以观察新骨沿骨粉边缘生成。3.统计学分析结果：经析因方差分析,各组间新生骨面积百分比有显著性差异(F=93.681,P=0.000),各时间段新生骨面积百分比有显著性差异(F=149.197,P=0.000)。处理组间与时间段间交互效应显著(F=13.294, P=0.000)。各时间段组间的两两比较,2周时,数据进行统计对比分析后显示B组与C组新生骨面积白分比数据比较(P=0.218),差异无统计学意义；C组与E组数据比较(P=0.292),差异无统计学意义,E组与F组数据比较(P=0.377),差异无统计学意义；其余各组两两间比较P值均小于0.05,差异具有统计学上意义。A组无胶原骨粉组,B组胶原骨粉组,C组游离rhBMP-2胶原骨粉组,D组rhBMP-2结合胶原骨粉组,E组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组,F组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉1：3均匀混合骨粉组各组新生骨面积百分比分别为15.22±2.44,21.18±1.9,22.93±2.56,30.21±2.35,21.44±2.81,20.19±2.3。可见2周时,D组rhBMP-2结合胶原骨粉组新生骨面积百分比最高,A组无胶原骨粉组新生骨面积百分比最小。4周时,各组新生骨面积百分比数据进行统计对比后显示,B组与C组及F组统计对比显示P值均大于0.05,差异无统计学意义；C组与F组相比(P=0.289),差异无统计学意义；其余各组两两间比较P值均小于0.05,差异具有统计学上意义。A组无胶原骨粉组,B组胶原骨粉组,C组游离rhBMP-2胶原骨粉组,D组rhBMP-2结合胶原小牛骨骨粉组,E组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组,F组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉1：3均匀混合骨粉组各组新生骨面积百分比分别为19.12±2.02,26.92±1.78,25.16±2.18,35.98±1.68,30.08±1.93,26.63±3.82。可见4周时D组rhBMP-2结合胶原骨粉组新生骨面积依然最高,E组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组在此期也开始表现出较强的成骨效应,其新生骨面积百分比仅次于D组,而高于其余A,C,E,F组。6周时,数据进行统计对比后显示,A组与C组之间数据统计分析(P=0.665),差异无统计学意义；D组与F组比较(P=0.327),差异无统计学意义；其余各组两两间比较P值均小于0.05,差异具有统计学上意义。A组无胶原骨粉组,B组胶原骨粉组,C组游离rhBMP-2胶原骨粉组,D组rhBMP-2结合胶原骨粉组,E组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组,F组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉1：3均匀混合骨粉组各组新生骨面积百分比分别为21.42±1.95,26.56±1.14,21.98±1.89,32.42±1.95,38.18±2.09,31.14±3.55。E组重组人骨形成蛋白-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组成骨最多。12周时,B组胶原骨粉组,C组游离rhBMP-2胶原骨粉组,D组rhBMP-2结合胶原骨粉组骨粉基本降解完全,同时新生骨质伴随吸收,而A组无胶原骨粉组,E组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组,F组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉1：3均匀混合骨粉组新生骨进一步增加,故仅对该3组新生骨面积百分比进行统计学分析。数据进行统计分析对比后显示P值均小于0.05,差异具有统计学上意义。A组无胶原骨粉组,E组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组,F组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉1：3均匀混合骨粉组各组新生骨面积百分比分别为27.63±1.95,53.46±7.48,35.22±2.67。E组rhBMP-2结合胶原骨粉与无胶原骨粉体积1：1均匀混合骨粉组依然表现出较强的成骨效应,新生骨量明显高于其他各组。结论：1.兔股骨远端干骺端骨缺损模型解剖部位固定,干骺线为术中重要参考标记；主要在松质骨区制作标准骨缺损,其空间是足够的；该动物模型应为骨组织替代材料用于大动物及临床前优先选用的一种较理想标准骨缺损模型；2. rhBMP-2结合胶原骨粉组在早期就表现出较强的成骨能力,表明具有良好的骨诱导特性；3. rhBMP-2结合胶原骨粉组早期成骨效果优于游离rhBMP-2胶原骨粉组；4.胶原在早期可促进成骨及促进骨组织替代材料的降解吸收；5. rhBMP-2结合胶原骨粉/无胶原骨粉混合表现出良好的骨诱导特性及骨引导特性,成骨效能增强；6. rhBMP-2结合胶原骨粉/无胶原骨粉成骨效能与rhBMP-2结合胶原骨粉含量有关

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-16
前言  16-20
第一部分兔股骨远端标准骨缺损模型的建立  20-30
  1.1 材料  20-21
  1.2 实验动物及实验方法  21-23
  1.3 实验样本采集及处理  23
  1.4 结果  23-27
  1.5 讨论  27-30
第二部分重组人骨形成蛋白-2结合胶原骨粉/无胶原骨粉在兔股骨远端标准骨缺损模型中成骨效能的研究  30-65
  2.1 材料与方法  30-36
  2.2 结果  36-57
    2.2.1 大白兔术后生活状态观察  36
    2.2.2 骨缺损标本大体观察  36-57
  2.3 讨论  57-65
全文结论  65-66
参考文献  66-71
攻读学位期间成果  71-72
中英文对照缩略词表  72-73
致谢  73-75
统计学证明  75-76

重组人骨形成蛋白-2结合胶原骨粉/无胶原骨粉在兔股骨远端标准骨缺损模型中成骨效能的研究

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