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生物标志物p53与miRNA的表面等离子体激元共振检测

作　者: 王永灿
导　师: 王建秀
学　校: 中南大学
专　业: 分析化学
关键词: 表面等离子体激元共振 p53蛋白 DNA miRNA 相互作用
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


表面等离子体激元共振(SPR)是一种基于物质相互作用引起芯片表面折射率或厚度变化而进行检测的光学技术,它是研究生物分子间相互作用的有力工具,具有实时、灵敏度高、免标记以及样品无需纯化等优点,在蛋白及核酸等生物分子检测方面具有广阔的应用前景。本文利用SPR技术的优势对两种生物标志物p53蛋白和miRNA进行了检测。首先,利用双通道SPR技术实现了对癌细胞溶胞液中野生型及总p53蛋白(野生型与突变型p53蛋白的总和)的高灵敏检测。将捕获野生型p53的一致性双链DNA以及特异性识别总p53蛋白的单克隆抗体分别组装到SPR芯片的两个通道上,通过流动注射p53蛋白的溶液,从而检测野生型及总p53蛋白的浓度水平。由于p53蛋白和一致性双链DNA以及单克隆抗体具有高度的亲和性,所以可检测极低浓度的p53蛋白水平。野生型及总p53蛋白所对应的SPR信号的差减可直接反应不同类型癌细胞中p53的突变量。同一SPR芯片上野生型与突变型p53蛋白的同时测定消除了以往不同方法、不同技术检测的不确定性。此外,该方法简单、无需对样品进行标记,克服了传统的酶联免疫吸附分析操作步骤烦琐、且使用酶标抗体的缺陷,为临床上癌症的预警及早期诊断提供了理论依据。miRNA是一组含有19-25个核苷酸的非编码小RNA。利用SPR技术免标记、高灵敏的特点,采用类似免疫竞争的方式,即表面固定的miRNA探针与miRNA靶基因及生物素标记的miRNA (biotin-miRNA)发生竞争杂交反应,随后流动注射纳米金粒子标记的抗生素蛋白。生物素与抗生素蛋白之间的特异性相互作用将纳米金粒子引入到传感器表面。随着miRNA浓度的增加,纳米金粒子放大所产生的SPR信号随之降低,从而建立对miRNA靶基因进行定量的分析方法。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章 绪论  8-22
  1.1 表面等离子体激元共振(SPR)  8-12
    1.1.1 SPR的发展概况  9
    1.1.2 SPR的基本原理  9-12
  1.2 SPR芯片的制备  12-17
    1.2.1 金属膜的制备  12-13
    1.2.2 组装膜厚度对表面等离子体激元共振光谱的影响  13-14
    1.2.3 生物分子的固定  14-17
  1.3 SPR动力学分析  17-19
  1.4 SPR的应用及新进展  19-20
    1.4.1 在生物领域中的应用  19-20
    1.4.2 SPR技术在方法学研究的新进展  20
  1.5 本论文的研究背景与意义  20-22
第二章 生物标志物p53蛋白的SPR检测  22-37
  2.1 引言  22-24
  2.2 实验部分  24-26
    2.2.1 实验试剂  24-25
    2.2.2 实验仪器  25-26
  2.3 实验过程  26-30
    2.3.1 溶液的配制  26-27
    2.3.2 SPR芯片表面修饰  27
    2.2.3 实验所用SPR装置  27-28
    2.2.4 仪器校正  28-30
    2.3.5 正常以及癌细胞溶胞液中p53蛋白的SPR检测  30
  2.4 结果与讨论  30-36
    2.4.1 检测原理  30-31
    2.4.2 野生型及总p53蛋白的SPR检测  31-32
    2.4.3 野生型p53蛋白识别分子的选择  32-34
    2.4.4 野生型及总p53蛋白浓度与SPR信号的关系  34-35
    2.4.5 正细胞及癌细胞中p53蛋白的检测  35-36
  2.5 结论  36-37
第三章 生物标志物miRNA的SPR检测  37-50
  3.1 引言  37-39
  3.2 实验部分  39-44
    3.2.1 药品与试剂  39-40
    3.2.2 仪器  40-41
    3.2.3 溶液的配制  41
    3.2.4 玻片处理和金膜制备  41
    3.2.5 实验所用SPR装置  41-42
    3.2.6 仪器校正  42-43
    3.2.7 实验步骤  43-44
  3.3 结果与讨论  44-49
    3.3.1 检测原理  44-45
    3.3.2 Dextran控制实验的条件优化  45-46
    3.3.3 biotin-miRNA的SPR检测  46-47
    3.3.4 miRNA检测的控制实验  47-48
    3.3.5 各浓度下biotin-miRNA的SPR检测  48-49
  3.4 总结  49-50
第四章 结论  50-51
参考文献  51-59
致谢  59-60
攻读学位期间主要的研究成果  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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