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视神经脊髓炎患者血清中抗水通道蛋白-4抗体的检测

作　者: 赵忙所
导　师: 耿同超
学　校: 清华大学
专　业: 内科学
关键词: 视神经脊髓炎多发性硬化 NMO-IgG 水通道蛋白-4
分类号: R744.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 31次
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内容摘要

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)是一种特发性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,根据流行病学、临床特点、影像学、病理学及实验室检查,特别是血清NMO-IgG即抗水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)抗体等资料,国外大多数学者改变了NMO隶属于多发性硬化(multiple sclerosis,MS)的传统观点,认为它有别于MS,是一种全新的中枢神经系统自身免疫通道病。目前,尚未见中国内地NMO患者血清中存在抗AQP4抗体的报道,为了调查中国内地NMO患者血清中是否存在抗AQP4抗体,本研究建立了稳定表达AQP4蛋白的HEK293细胞株。从颞叶癫痫患者脑组织提取总RNA,使用RT-PCR扩增AQP4基因,构建AQP4-GFP融合表达重组体pEGFP-N1-AQP4,转染HEK293细胞,抗生素联合流式细胞仪筛选AQP4-GFP稳定表达细胞株。结果显示,其稳定表达率达80%~90%,RT-PCR和免疫荧光法证实该细胞株表达AQP4蛋白,激光共聚焦显微镜进一步确认AQP4-GFP融合蛋白主要表达于细胞膜上。在此基础上,我们收集了NMO、MS、神经系统其他疾病患者血清,并以健康正常人的血清作为阴性对照,利用已建立的稳定表达AQP4蛋白的HEK293细胞为“抗原”借助免疫荧光法检测了这些患者血清中的抗AQP4抗体。结果表明,中国内地NMO患者血清中也存在抗AQP4抗体,该方法对NMO诊断的灵敏度为88%,特异度为96.1%。为了建立适于临床推广的抗AQP4抗体简便有效的检测方法,我们初步探讨了以合成多肽为抗原的ELISA法检测NMO患者血清中的抗AQP4抗体,首次证明了AQP4蛋白细胞膜外的某些多肽段可作为ELISA检测抗原,用于检测患者血清中的抗AQP4抗体。总之,本研究证实了中国内地NMO患者血清中存在抗AQP4抗体,并初步建立了一个简便有效的NMO患者血清中抗AQP4抗体的检测方法,为我国NMO的诊疗提供了重要依据。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
第1章引言  10-29
  1.1 NMO 作为一种独立疾病的证据  10-14
    1.1.1 流行病学  10
    1.1.2 临床特征  10-11
    1.1.3 实验室检查  11
    1.1.4 影像学  11-12
    1.1.5 组织病理变化  12-14
  1.2 自身抗体NMO-IgG 的发现  14
  1.3 AQP4 蛋白：NMO-IgG 的靶点  14
  1.4 AQP4 蛋白概述  14-17
  1.5 AQP4 与中枢神经系统疾病  17-18
    1.5.1 AQP4 蛋白与脑水肿  17
    1.5.2 AQP4 蛋白与癫痫  17-18
    1.5.3 AQP4 蛋白与其他中枢神经系统疾病  18
  1.6 抗AQP4 抗体与NMO  18-19
  1.7 NMO 的临床治疗进展  19-27
    1.7.1 免疫抑制剂  19-23
      1.7.1.1 糖皮质激素  20-21
      1.7.1.2 硫唑嘌呤  21
      1.7.1.3 环磷酰胺  21-22
      1.7.1.4 醚托蒽醌  22-23
      1.7.1.5 麦考酚酯  23
    1.7.2 血浆交换  23-24
    1.7.3 静脉注射免疫球蛋白  24-25
    1.7.4 利妥昔单抗  25
    1.7.5 免疫调节剂  25-27
    1.7.6 治疗策略小结  27
  1.8 抗AQP4 抗体的检测  27-29
第2章稳定表达AQP4 蛋白的HEK293细胞株的建立与鉴定  29-40
  2.1 试验材料  29-30
    2.1.1 主要材料与试剂  29
    2.1.2 主要液体的配置  29-30
    2.1.3 主要仪器和设备  30
  2.2 试验方法  30-35
    2.2.1 AQP4 基因的获取  30-33
      2.2.1.1 RNA 的提取  30-31
      2.2.1.2 RT-PCR 获取AQP4 基因  31-33
    2.2.2 重组质粒pEGFP-N1- AQP4 的构建和鉴定  33
    2.2.3 细胞转染重组质粒pEGFP-N1- AQP4  33-34
    2.2.4 抗生素联合流式细胞仪筛选AQP4 蛋白稳定表达株  34
      2.2.4.1 HEK293 细胞G418 耐药性试验  34
      2.2.4.2 G418 筛选稳定表达AQP4 蛋白的HEK293 细胞  34
      2.2.4.3 流式细胞仪分选GFP 阳性细胞  34
    2.2.5 RT-PCR 鉴定AQP4 基因表达  34-35
    2.2.6 免疫荧光法鉴定AQP4 蛋白表达  35
    2.2.7 AQP4-GFP 融合蛋白的细胞定位  35
  2.3 结果  35-40
    2.3.1 RT-PCR 扩增AQP4 基因  35
    2.3.2 重组质粒pEGFP-N1-AQP4 的构建  35-36
    2.3.3 重组质粒pEGFP-N1-AQP4 的鉴定  36-37
    2.3.4 基因转染与稳定表达AQP4 细胞株的筛选  37
    2.3.5 RT-PCR 鉴定AQP4 基因表达  37-38
    2.3.6 免疫荧光法鉴定AQP4 蛋白表达  38
    2.3.7 AQP4-GFP 融合蛋白的细胞定位  38-40
第3章视神经脊髓炎患者血清中抗AQP4抗体的检测  40-48
  3.1 试验样本获取  40-41
  3.2 试验方法  41-45
    3.2.1 免疫荧光法检测患者血清  41-42
    3.2.2 EDSS (Expanded Disability Status Scale)评分  42-44
    3.2.3 治疗方案  44-45
    3.2.4 统计分析  45
  3.3 结果  45-48
    3.3.1 NMO 的临床特点  45-46
    3.3.2 抗AQP4 抗体滴度和EDSS 评分  46-47
    3.3.3 AQP4 抗体对NMO 诊断的敏感性和特异度  47-48
第4章结论  48-50
第5章以合成多肽为抗原的ELISA法检测NMO患者血清中抗AQP4抗体初探  50-62
  5.1 ELISA 简介  50-51
  5.2 模拟抗原多肽的选择  51-55
  5.3 以合成多肽为抗原的ELISA 法试验步骤  55-56
  5.4 结果  56-59
  5.5 讨论  59-60
  5.6 总结与展望  60-62
参考文献  62-67
致谢  67-68
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  68

视神经脊髓炎患者血清中抗水通道蛋白-4抗体的检测

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