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光棘球海胆MYP基因非编码区序列及其SNPs分析

作　者: 耿慧君
导　师: 赫崇波；周遵春
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 光棘球海胆主要卵黄蛋白基因组步移单核甘酸多态性生物信息学
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

海胆的主要卵黄蛋白,因大量存在于海胆卵中而曾一度被归为卵黄蛋白原。但不同于其它物种的雌性特有,MYP同时存在于海胆精巢和卵巢中,为配子发生及胚胎发育提供营养。比对发现,其cDNA序列与其他物种卵黄蛋白原并无明显相似性,而与铁传递蛋白具有更高的相似性。据其存在场所和合成时期的差异,MYP可分为为CFMYP和EGMYP,二者均由同一基因编码。因其特殊性,国内外相关研究很多,并仍在持续进行。光棘球海胆不仅是我国重要的增养殖品种之一,且在发育生物学、遗传学、分子生物学等学科均有很好的科研价值。本实验选用光棘球海胆,对其主要卵黄蛋白MYP基因区域进行相关研究,旨在为MYP的下一步研究奠定基础。利用基因组步移方法,获得了MYP基因上下游未知序列,并通过常规PCR及克隆测序等获得基因组9个内含子的序列。在研究过程中,利用生物信息学对MYP上下游序列进行顺式作用元件分析。并选用基因下游,及内含子20的核苷酸序列进行SNPs检测。现将实验结果总结如下:1、经3次步移及克隆测序,获得MYP基因上游1782bp,应用生物信息学预测了其启动子,得到两条启动子序列P1和P2,P1起始于-96bp,P2起始于-565bp,两条序列均为50bp。在P1、P2序列中分别包含有GC box,GAGA box和CAAT box。推测MYP基因的两条启动子序列,在胚胎发育的不同时期分别对母源性卵黄蛋白(EGMYP)和体腔卵黄蛋白(CFMYP)的表达具有不同的调控作用。利用Tfsitescan软件,在MYP基因上游区域发现含有多种顺式作用元件,如:AP1-TRE0/C、NRE_Box1_CS、IRF-E、ASK-MP4等。这说明MYP的表达调控方式复杂,受多条信号通路的共同调节。2、经2次基因组步移和一次常规PCR,获得了MYP基因下游共1182bp的序列。经Clustalx比对处理,得有效长度821bp。认为所得到的区域为光棘球海胆MYP编码前体mRNA的DNA序列,可被识别并转录形成前体mRNA,但在前体mRNA的后期剪接过程中被除去,并不参与后期功能蛋白的合成。经鉴定,在所获得的MYP下游区域序列中,存在两种信号元件,效率元件(EE)ATATAT(59bp-64bp),和定位元件(PE)TTTTTTTT(347bp-354bp)。这些元件可能在MYP mRNA的后期剪辑、折叠、以及相关反式作用因子的识别与定位中起一定作用。3、MYP下游区域序列中,存在一些SNP突变位点,如622位存在A—G转换,648位存在T缺失等。这些突变可能影响到后期mRNA的修饰,而导致功能蛋白质的差异。4、获得MYP基因内含子5、6、11、14、15、16、17、18、及20的全部序列,总长5036 bp。经网上进行Blast发现,该九段序列均为新发现的未知序列。对部分内含子进行SNP检测,得内含子20的189位存在A—C突变,这些突变可能影响到前体mRNA的处理与修饰,从而在蛋白质水平造成差异。以上将为进一步研究MYP基因的表达调控和全基因的SNPS筛选奠定基础。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章文献综述  12-36
  前言  12
  1 海胆概述及研究背景  12-16
    1.1 海胆的生物学地位及研究意义  12-14
    1.2 光棘球海胆的研究进展  14
    1.3 海胆基因组计划  14-16
  2 海胆MYP的研究进展  16-20
    2.1 海胆MYP的概念及分类  16-17
    2.2 海胆MYP与其他物种卵黄蛋白(原)比较  17-19
      2.2.1 发生比较  17
      2.2.2 结构及分子量比较  17-18
      2.2.3 功能比较  18-19
    2.3 海胆MYP研究进展及前景  19-20
  3 基因侧翼序列的获得  20-24
    3.1 质粒拯救(plasmid rescue)法  21
    3.2 反向PCR(inverse or inverted PCR,IPCR)法  21-22
    3.3 PCR-walking  22
    3.4 连接介导PCR(Ligation-mediated PCR,LMPCR)  22-23
    3.5 热不对称交错PCR(TAIL-PCR)  23-24
  4 SNP标记的兴起和应用  24-31
    4.1 分子标记  24-25
    4.2 分子标记的种类及应用  25-27
    4.3 单核苷酸多态性(SNPs)  27-31
      4.3.1 SNPs的优势和特点  27-28
      4.3.2 SNPs的分析方法  28
      4.3.3 SNPs的检测方法  28-31
  参考文献  31-36
第二章海胆MYP基因侧翼序列的获得及分析  36-56
  1 材料  36
    1.1 实验材料  36
    1.2 仪器设备  36
    1.3 实验试剂及配制  36
  2 方法  36-44
    2.1 海胆总DNA的纯化提取  36-37
      2.1.1 实验之前的准备  37
      2.1.2 实验操作步骤  37
    2.2 MYP基因上游区域引物设计  37-38
    2.3 MYP基因下游区域引物设计  38-39
    2.4 Genome Walking  39-42
      2.4.1 实验原理  39-40
      2.4.2 特异性引物设计原则  40
      2.4.3 实验步骤  40-42
      2.4.4 实验流程简图  42
    2.5 PCR产物的克隆测序  42-44
      2.5.1 PCR产物的纯化回收  42-43
      2.5.2 大肠杆菌感受态细胞的制备  43-44
      2.5.3 纯化产物与质粒载体的连接反应  44
      2.5.4 感受态细胞的转化  44
      2.5.5 转化子的筛选与鉴定  44
      2.5.6 阳性克隆测序及分析  44
  3 结果与分析  44-51
    3.1 MYP基因上游启动子区域序列  44-48
      3.1.1 测序结果  44-46
      3.1.2 结果分析  46-48
        3.1.2.1 同源性比对  46
        3.1.2.2 网络分析工具  46
        3.1.2.3 MYP基因启动子结构分析  46
        3.1.2.4 MYP转录调控区中转录因子结合序列  46-48
    3.2 MYP基因下游分析  48-51
      3.2.1 测序结果  48-49
      3.2.2 SNPs检测  49
      3.2.3 结果分析  49-51
        3.2.3.1 序列处理  49
        3.2.3.2 同源性比对  49-50
        3.2.3.3 SNP分析  50-51
        3.2.3.4 多聚腺苷作用信号分析  51
  4 讨论  51-53
    4.1 MYP基因上游  51-52
    4.2 MYP基因下游  52-53
  5 小结  53-54
  参考文献  54-56
第三章海胆MYP基因内含子系列的获得及分析  56-71
  1 材料  56-57
    1.1 实验材料  56
    1.2 实验试剂及配制  56-57
  2 方法  57-59
    2.1 海胆总DNA的提取  57
    2.2 DNA样品的检测  57-58
      2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测  57
      2.2.2 分光光度法检测  57-58
    2.3 引物设计  58-59
    2.4 PCR扩增条件  59
    2.5 测序及序列分析  59
  3 结果与分析  59-67
    3.1 测序及序列分析  59-66
      3.1.1 内含子5、6,外显子6  59-61
        3.1.1.1 测序结果  59-60
        3.1.1.2 序列分析  60-61
      3.1.2 内含子11  61-62
        3.1.2.1 测序结果  61
        3.1.2.2 序列分析  61-62
      3.1.3 内含子14、15,外显子15  62-63
        3.1.3.1 测序结果  62-63
        3.1.3.2 序列分析  63
      3.1.4 内含子16  63
        3.1.4.1 测序结果  63
        3.1.4.2 序列分析  63
      3.1.5 内含子17  63-65
        3.1.5.1 测序结果  63-64
        3.1.5.2 序列分析  64-65
      3.1.6 内含子18  65-66
        3.1.6.1 测序结果  65
        3.1.6.2 序列分析  65-66
      3.1.7 内含子20  66
        3.1.7.1 测序结果  66
        3.1.7.2 序列分析  66
    3.2 内含子20的SNPs分析  66-67
  4 讨论  67-68
  5 小结  68-69
  参考文献  69-71
附录  71-78
  附录A 常用缩写词及英汉对照  71-72
  附录B MYP基因mRNA及上下游、部分内含子序列  72-78
致谢  78-79
作者简介  79-80

光棘球海胆MYP基因非编码区序列及其SNPs分析

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