学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

侧孢短芽孢杆菌侵染性蛋白酶的表达及其随机突变文库的构建

作　者: 柯崇榕
导　师: 黄建忠；田宝玉
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 侧孢短芽孢杆菌线虫丝氨酸蛋白酶BLG4 侵染机制随机突变文库定向进化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 100次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

植物寄生线虫是植物的重要病害之一,已成为制约农业生产良好发展的重要因素。生物防治线虫具有对环境和人类危害小并且不会产生抗药性的优势,已成为线虫防治的研究热点。然而以天然活菌剂为基础的生物杀线剂毒力小、稳定性差对温度敏感造成实际生防效果缓慢效率低下。因此,研究食线虫微生物侵染线虫的毒力因子及其作用的分子机制对提高生物杀线剂的稳定性和毒力,促进生物杀线剂的实际生防效率具有重要的意义。侧孢短芽孢杆菌G4产生的丝氨酸蛋白酶BLG4是强杀线虫的主要毒力因子,是研究丝氨酸蛋白酶侵染线虫机制的理想材料。本论文通过蛋白质定向进化技术研究丝氨酸蛋白酶降解线虫体壁并杀死线虫的结构基础和分子机理。通过对16S rRNA基因序列的分析,从分子水平上确认出发菌就是具有高效杀线虫毒力的Brevibacillus laterosporus G4菌株;利用单因素试验结合Plackett-Burman设计和响应面法设计优化B.laterosporus G4的发酵培养体系,获得的培养体系摇瓶发酵30小时蛋白酶活力可达12379 U/ml,比优化前提高了5倍。采用单因素设计试验对芽孢杆菌转化体系进行优化,获得的转化系统电转效率可达6.0×10~4 cfu/μgDNA,存活率达到3.0%;分别利用枯草芽孢杆菌整合型表达载体pSG1729B和自主独立复制型表达载体pHY3000PLK构建蛋白酶BLG4的异源重组表达质粒,并成功实现在B.subtilis WB600中的稳定高效和高通量表达。运用易错PCR技术扩增蛋白酶BLG4的成熟肽片段,然后采用重叠延伸PCR技术获得具有完整编码区的突变基因,连接到pMD-T 18 Simple Vector构建库容约为5.1×10~4 cfu、突变率为0.536%的高质量蛋白酶BLG4的随机突变文库。应用B.subtilis WB600表达体系构建蛋白酶BLG4的随机突变表达文库,高通量筛选获得热稳定性得到较大改善的突变体Mut-01。通过对突变体Mut-01的氨基酸序列和模拟的空间结构分析表明,207位的Cys与222位的Met引入形成的二硫键,使得突变体的空间结构更加紧凑稳定是热稳定性提高的主要原因,为提高生物杀线剂的实际生防稳定性提高了理论基础。突变文库的构建及其分析为下一步筛选侵染线虫活性发生改变的突变子,研究侵染酶降解线虫体壁的结构基础和分子机理奠定了基础。

全文目录

中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-13
绪论  13-37
  第一节植物寄生性线虫的生物防治  14-22
    1.1 食线虫细菌的研究概况  15-18
    1.2 食线虫微生物的胞外酶  18-22
  第二节枯草芽孢杆菌表达系统  22-27
    2.1 枯草杆菌表达系统特点  23
    2.2 芽孢杆菌表达系统中的载体  23-26
    2.3 枯草杆菌的分泌表达系统  26-27
  第三节蛋白酶的定向分子进化  27-36
    3.1 分子定向进化文库的构建  28-32
    3.2 分子定向进化文库的筛选  32-34
    3.3 分子定向进化的应用  34-36
  第四节课题的研究内容与意义  36-37
    4.1 课题研究内容  36
    4.2 课题研究的目的与意义  36-37
第一章侧孢短芽孢杆菌G4的高密度培养  37-61
  第一节材料与方法  37-44
    1.1 材料  37-39
    1.2 实验方法  39-44
  第二节结果与分析  44-59
    2.1 16S rDNA基因的扩增与鉴定  44-45
    2.2 16S rDNA基因的同源性分析  45-46
    2.3 蛋白酶BLG4活力的分析  46-47
    2.4 单因素试验优化  47
    2.5 Plackett—Burman试验设计  47-50
    2.6 响应面Box-Behnken试验设计优化  50-58
    2.7 最优发酵配方组合的验证  58-59
  第三节小结与讨论  59-61
第二章芽孢杆菌高效电转体系的建立  61-75
  第一节材料与方法  61-66
    1.1 材料  61-63
    1.2 实验方法  63-66
  第二节结果与分析  66-72
    2.1 芽孢杆菌的生长曲线  66
    2.2 芽孢杆菌的抗生素敏感性分析  66-67
    2.3 质粒pSG1729的鉴定  67-68
    2.4 细胞生长时间对电转化率的影响  68-69
    2.5 恢复培养基对电转化率的影响  69-70
    2.6 生长培养基对电转化率的影响  70
    2.7 电场强度对电转化率的影响  70-71
    2.8 电击缓冲液对电转化率的影响  71-72
    2.9 电转化参数的确定  72
  第三节小结与讨论  72-75
第三章丝氨酸蛋白酶BLG4的异源表达  75-91
  第一节材料与方法  75-79
    1.1 材料  75-76
    1.2 实验方法  76-79
  第二节结果与分析  79-87
    2.1 蛋白酶BLG4基因的扩增  79-80
    2.2 重组子pMDS-APR的构建  80-82
    2.3 表达重组质粒的构建与鉴定  82-84
    2.4 枯草杆菌转化子的鉴定  84-85
    2.5 枯草杆菌转化子蛋白酶活性分析  85-87
    2.6 枯草杆菌转化子发醉上清的SDS-PAGE分析  87
  第三节小结与讨论  87-91
第四章蛋白酶BLG4随机突变文库的构建  91-107
  第一节材料与方法  91-95
    1.1 材料  91-92
    1.2 实验方法  92-95
  第二节结果与分析  95-104
    2.1 蛋白酶BLG4前肤和终止子的扩增  95
    2.2 蛋白酶BLG4成熟肽的易错PCR  95-96
    2.3 蛋白酶BLG4成熟肤易错PCR突变率的分析  96-98
    2.4 蛋白酶BLG4融合PCR体系的建立  98-100
    2.5 蛋白酶BLG4突变文库的构建与验证  100-101
    2.6 蛋白酶BLG4基因随机突变文库的分析  101
    2.7 蛋白酶BLG4突变子的测序分析  101-104
  第三节小结与讨论  104-107
第五章蛋白酶BLG4突变子筛选及其生物信息学分析  107-121
  第一节材料与方法  107-109
    1.1 材料  107
    1.2 实验方法  107-109
  第二节结果与分析  109-120
    2.1 蛋白酶BLG4随机突变表达文库的构建  109-110
    2.2 蛋白酶BLG4随机突变表达文库的筛选  110
    2.3 突变体Mut-01的基因测序与分析  110
    2.4 体壁降解蛋白的氨基酸序列比对分析  110-112
    2.5 蛋白酶BLG4的信号肽预测分析  112
    2.6 突变体Mut-01的理化表征分析  112-114
    2.7 突变体Mut-01的疏水性和跨膜分析  114-115
    2.8 蛋白酶BLG4蛋白质活性结构域预测  115
    2.9 突变体Mut-01的同源模建分析  115-118
    2.10 突变体Mut-01热稳定性提高的分子基础  118-120
  第三节小结与讨论  120-121
结论  121-123
附录主要符号缩略表  123-125
参考文献  125-139
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  139-141
致谢  141-143
个人简历  143

侧孢短芽孢杆菌侵染性蛋白酶的表达及其随机突变文库的构建

内容摘要

全文目录

相似论文