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可光致异构化昆虫激肽的合成、活性及结构研究

作　者: 丛志远
导　师: 董守良
学　校: 兰州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 昆虫激肽 硫代肽键 光致异构化 2D-NMR 量子化学计算
分类号: Q966
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 5次
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内容摘要


目的:将硫代肽键光导模块构建到昆虫激肽核心五肽中,通过紫外光控制肽结构来研究其活性构象,并对硫代肽键调节昆虫激肽激动/拮抗活性转换的可行性进行探索;对良好活性的类似物进行二维核磁结构解析及量子化学计算,从而更深入地了解昆虫激肽确切的构效关系,为其在无脊椎动物研究领域和害虫防治方面的应用奠定基础。方法:以P2S5作为硫化试剂合成类似物H-Phe1-TyT2-ψ[CS-N]-Pro3-Trp4-Gly5-NH2（ψ[CS-N]2-kinin）与H-Phe1-Phe2-ψ[CS-NH]-D-Ala3-Trp4-Gly5-NH2（ψ[CS-NH]2-kinin）;用UV-vis、HPLC对其光致异构化进行表征;以促蟑螂后肠收缩实验进行活性评价;通过DQF-COSY、TOCSY、ROESY研究ψ[CS-N]2-kinin的溶液构象;并用GAMESS软件对两个类似物改造部位二肽（ψ[CS-N]-YP,ψ[CS-NH]-F（D）A）的顺反异构能垒进行计算。结果:经254 nm紫外光照后,ψ[CS-N]2-kinin的顺式含量由15.7%增为47.7%,通过热弛豫,又降至15.2%,热弛豫半衰期为40 min;而ψ[CS-NH]2-kinin的热弛豫半衰期仅为80 sec;活性研究显示:ψ[CS-N]2-kinin保留了母肽80%的活性,EC50=（4.1±0.2）×10-7 M,经紫外光照后,其活性显著增强,EC50=（1.1±0.2）×10-7M,热弛豫后,其活性又恢复到未光照水平,EC50=（3.9±0.3）×10-7 M。而ψ[CS-NH]2-kinin因其相对快的热弛豫,光照对其活性无显著影响,EC50=（6.8±0.2）×10-7 M,保留了母肽50%的活性,该反式异构体对母肽无拮抗作用;2D-NMR表明:未光照时,ψ[CS-N]2-kinin的优势构象为反式Pro异构体,2、4位残基侧链芳环相靠近,形成一个芳香表面,但肽骨架未形成规则β-转角,这与未光照时其相对低的收缩活性对应;异构化能垒计算显示:在HF/STO-3G基组水平,二肽β[CS-N]-YP能垒为23.58 kcal/mol,ψ[CS-NH]-F（D）A为17.04 kcal/mol;在HF/6-31G（d,p）水平,ψ[CS-N]-YP为22.98 kcal/mol,ψ[CS-Nn]-F（D）A为19.69kcal/mol。结论:紫外光可控制昆虫激肽硫代类似物的构象,进而控制其活性变化;ψ[CS-N]2-kinin顺式Pro异构体为活性构象;2、3位顺式肽键对激肽与受体偶合至关重要;Pro可增加硫代肽键异构化能垒,具有稳定该光导模块的作用。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-18
  1.1 硫取代肽键研究背景  8-9
  1.2 昆虫激肽的研究背景  9-18
    1.2.1 昆虫激肽的发现和分离提取  9-11
    1.2.2 昆虫激肽的生理功能  11-13
    1.2.3 昆虫激肽的构效关系研究  13-16
    1.2.4 昆虫激肽与受体的作用机制  16-18
2 立题根据与实验设计  18-21
  2.1 立题根据  18-19
  2.2 实验设计  19
  2.3 实验内容  19-21
3 材料与方法  21-32
  3.1 实验材料与仪器  21-22
    3.1.1 试剂  21
    3.1.2 实验动物  21
    3.1.3 仪器设备  21-22
  3.2 实验方法  22-32
    3.2.1 硫代氨基酸(Fmoc-Aa-ψ[CS-N]-6-TNB)改造  22-24
      3.2.1.1 混合酸酐法合成Fmoc-Tyr(tBu)-5-nitroanilide  23
      3.2.1.2 硫化合成Fmoc-Tyr(tBu)-5-nitrothioanilide  23-24
      3.2.1.3 重氮化合成Fmoc-Tyr(tBu)-ψ[CS-N]-6-nitrobenzotriazolide  24
    3.2.2 肽合成  24-25
    3.2.3 肽分析纯化  25-26
    3.2.4 光致异构化表征  26-27
      3.2.4.1 光致异构化UV-vis表征  26
      3.2.4.2 光稳定态cis/trans异构化速率常数测量  26-27
      3.2.4.3 光致异构化RP-HPLC表征  27
    3.2.5 蟑螂离体后肠收缩实验  27-28
      3.2.5.1 美洲大蠊营养液配制  27
      3.2.5.2 后肠标本的制作与测试方法  27-28
    3.2.6 类似物ψ[CS-N]2-kinin的2D-NMR解析及计算  28-30
      3.2.6.1 2D-NMR实验  28-29
      3.2.6.2 依据2D-NMR实验数据进行结构计算  29-30
    3.2.7 类似物改造位置二肽的异构化能垒计算  30-32
4 结果与分析  32-42
  4.1 氨基酸改造及肽合成结果  32-34
    4.1.1 Fmoc-Phe-ψ[CS-N]-6-TNB的合成过程说明  32
    4.1.2 Fmoc-Tyr(tBu)-ψ[CS-N]-6-TNB的合成结果  32-33
    4.1.3 母肽及改造肽的合成结果  33-34
  4.2 光致异构化表征结果  34-36
    4.2.1 光致异构化的UV-vis表征  34-35
    4.2.2 光致异构化的RP-HPLC表征  35-36
  4.3 蟑螂离体后肠收缩实验  36-37
  4.4 二维核磁结构解析  37-40
  4.5 异构化能垒计算结果  40-42
5 结论及意义  42-45
参考文献  45-52
个人简介及研究成果  52-53
致谢  53

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中图分类: > 生物科学 > 昆虫学 > 昆虫生物化学
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