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假性甲状旁腺功能减退家系致病位点筛查及GNAS基因c.952 T>C对Gas功能的影响

作　者: 王灿
导　师: 苗志敏
学　校: 青岛大学
专　业: 内分泌与代谢病
关键词: 假性甲状旁腺功能减退 GNAS基因 AHO体征
分类号: R582.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 28次
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内容摘要

目的：假性甲状旁腺功能减退Ⅰa型(PHPIa)是由GNAS基因突变引起。门诊发现矮胖圆脸、指趾骨粗短病人、血PTH水平升高病人,为明确病人诊断进一步行生化检查、基因突变筛查；体外突变体构建明确突变对Gas功能的影响。方法：对患者及其家属进行甲状旁腺素、促甲状腺激素,促性腺激素,雌二醇及血钙磷等检测。用13对引物对病人及其家系GNAS基因进行外显子及外显子内含子交界区扩增与测序,发现GNAS c.952 T>C。购买肾脏cDNA,用分别带有XhoⅠ和HindⅢ的上下游引物扩增G s a c DNA,产物纯化酶切后,与用X h oⅠ和HindⅢ酶切后的p c DNA3.1 (-)用连接酶连接,构建GNAS—pcDNA3.1野生型载体,定点突变获得GNAS c.952 T>C—PcDNA3.1载体,测序证实后,转化大肠杆菌并摇菌200ml,用QIAGEN质粒大抽试剂盒抽提质粒,用脂质体法瞬时转染OK细胞,培养48小时,用Promega cAMP检测试剂盒对野生型、突变型及空载转染的OK细胞进行空白及PTH刺激状态下的cAMP检测,观察突变对功能的影响。重复该实验3次。同源建模初步探讨该突变引起Gsa功能改变的可能机制。结果：(1)生化及激素结果提示：患者存在多激素抵抗体,其家属正常；(2)基因测序结果显示患者及其母亲存在GNAS基因c.952 T>C突变；(3)载体构建测序结果显示载体构建成功,野生型与突变型仅存在c.952 T>C的差异；(4)c AMP检测结果提示：突变型c AMP水平较野生型明显下降(P<0.001),较空载转染的OK细胞有所增加(P<0.01)；(5)同源建模结果提示：该突变位于基因保守区,其改变可能导致Gsa与Gsβγ相互作用障碍,从而影响该蛋白的功能。结论：患者确诊为假性甲状旁腺功能减退Ⅰa型,该疾病是由GNAS c.952 T>C引起,体外实验证实该突变可以引起Gas功能下降,而该功能下降可能是由于Gsa与Gsβγ相互作用障碍引起。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-5
引言  5-6
第一章病人情况描述与GNAS基因检测  6-10
  第一节病人基本情况及激素检测  6-7
  第二节 GNAS基因检测  7-10
第二章生物信息技术的应用  10-11
  第一节 GNAS基因保守性分析  10
  第二节同源建模及功能预测  10-11
第三章 Gas野生型与突变型功能检测  11-21
  第一节载体构建  11-17
  第二节 OK细胞转染及cAMP检测  17-21
第四章讨论  21-23
结论  23-24
参考文献  24-27
综述  27-37
  参考文献  33-37
攻读学位期间的研究成果  37-38
附录  38-42
致谢  42-43

假性甲状旁腺功能减退家系致病位点筛查及GNAS基因c.952 T>C对Gas功能的影响

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