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低氧诱导因子-1α在后处理保护高胆固醇血症大鼠缺血心肌中的作用

作　者: 李晓宇
导　师: 刘慧荣
学　校: 山西医科大学
专　业: 生理学
关键词: 缺氧诱导因子高胆固醇血症缺血/再灌注损伤后处理 DMOG
分类号: R589.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景心肌缺血后尽早对缺血区进行血液再灌注是阻止心肌细胞死亡的唯一有效途径,然而,再灌注本身会加重并扩大缺血后心肌细胞损伤,即发生再灌注损伤。高胆固醇血症(hypercholesterolemiahyperlipemia,HC)及其随后发生的动脉粥样硬化,是临床最常见的导致心肌缺血的因素之一,流行病学研究结果表明,HC并发心肌缺血患者治疗过程中再灌注损伤程度明显高于无HC心肌缺血患者,提示HC提高了心肌细胞对缺血／再灌注损伤的易感性。因此,减轻HC患者心肌缺血／再灌注损伤,最大限度地保护缺血心肌,是治疗缺血性心脏病的关键。2003年Zhao等首次提出了“缺血后处理”(ischemic. postconditioning,PostC)的概念,即在长时间再灌注开始前,预先对心肌进行短暂、反复的再缺血／再灌注干预,也可以减轻随后的再灌注损伤。由于后处理是在心肌缺血后进行,因此具有很强的临床可行性。目前,后处理的保护效应已经在不同种属动物模型和临床观察中得到证实,但是其对HC大鼠缺血再灌注心肌的效应及相关机制还不清楚。心肌缺血可引起复杂的病理生理变化,缺氧是其中的重要环节。近年研究发现,转录因子低氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)在氧平衡调节中起关键作用。HIF-1是包含α和β两个亚基的异源二聚体,其中HIF-1α的蛋白稳定性和转录活性均受细胞内氧浓度的调节,而HIF-1β呈构成性表达,不受细胞氧浓度的调节,因此HIF-1的生理活性主要取决于其α亚基的表达和活性。在常氧状态下,HIF-1α在脯氨酸羟化酶(prolyl hydroylase, PHD)的作用下发生氧依赖性的羟基化反应而被诱导降解；在缺氧时由于其羟基化作用受到抑制而使HIF-1α在细胞内聚集并活化,促进其调控的靶基因转录,从而引起相应的缺氧适应性反应。已有基础和临床研究结果证实,HIF-1α的增高可能是心肌缺血时首发的分子反应,对心肌组织适应缺氧环境具有重要意义。我们实验室前期研究结果表明,在大鼠心肌缺血／再灌注时给予后处理,可以使心肌组织中HIF-1α蛋白水平显著上调,但是,这种效应是否也存在于HC大鼠缺血／再灌注心肌需要通过实验予以证实。综上所述,HIF-1α在心肌缺血／再灌注中表达增加,但后处理对单纯的HC情况下缺血／再灌注心肌的保护作用是否与HIF-1α相关,以及HIF-1α表达水平的改变是否会影响后处理对单纯的HC情况下缺血／再灌注心肌的保护作用等目前仍不十分清楚。在本研究通过建立食源性HC大鼠模型,在此基础上运用TTC染色、CK活性检测,TUNEL和Caspase-3舌性检测技术等方法观察缺血后处理大鼠的心梗面积、心肌细胞凋亡发生情况；运用免疫印迹、、荧光定量PCR等方法观察大鼠缺血后处理心肌中HIF-1α的表达情况,以及这些变化与心肌损伤之间的关系；通过运用PHD药理学抑制剂(?)MOG使HIF-1α表达上调以及siRNA技术沉默HIF-1α,分别观察缺氧后处理对培养的高胆固醇心肌细胞损伤、细胞存活等的影响,而进一步探讨HIF-1α在高胆固醇血症大鼠后处理保护机制中的作用。目的1、观察后处理对高胆固醇血症大鼠心肌组织缺血／再灌注损伤的保护效应；2、观察HIF-1α在高胆固醇血症大鼠缺血／再灌注心肌中的表达和后处理时HIF-1α表达的变化,探讨HIF-1α是否参与后处理的心肌保护效应；3、给予培养心肌细胞高胆固醇处理,通过制备缺氧／复氧及缺氧后处理模型,利用RNAi技术观察HIF-1α在后处理对高胆固醇环境下心肌细胞缺氧／复氧损伤保护效应中的作用。方法一、在体大鼠模型：1、选取健康Wistar大鼠50只,随机分为以下5组：(1)普通伪手术组(Sham, n=10):普通饮食饲养10周,冠状动脉左前降支(LAD)下穿线,不结扎,持续210min;(2)高胆固醇血症伪手术组(HC+Sham, n=10):高胆固醇饮食饲养10周,冠状动脉左前降支(LAD)下穿线,不结扎,持续210min；(3)高胆固醇血症缺血／再灌注组(HC+MI/R, n=10):高胆固醇饮食饲养10周,冠状动脉左前降支下穿线结扎造成缺血30min,松开结扎线再灌注180min；(4)高胆固醇血症缺血后处理组(HC+PostC, n=10):高胆固醇饮食饲养10周,结扎冠状动脉左前降支缺血30mm,随即进行10s再灌注+10s再缺血,重复3次,随后再进行180min再灌注；(5) DMOG+高胆固醇血症后处理组(HC+DMOG+PostC, n=10):缺血前24h腹腔注射DMOG(40mg/kg),其余操作同(4)。2、心肌梗死面积测定：采用Evans blue和TTC双染法,正常的心肌组织被染成蓝色,缺血但未梗死的心肌组织被染为红色,梗死的心肌组织为白色。图像分析测定各区域面积：危险区面积(AAR/LV,%)=(危险区总面积／左心室面积)×100%；心梗面积(An/AAR,%)=(梗死区面积／危险区总面积)×100%3、测定血清肌酸激酶(CK)的活性来反映心肌损伤情况；4、分别采用原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3活性测定法检测大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况；5、用Western-blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α的蛋白表达水平；6、用real-time PCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1αmRNA的表达水平。二、离体细胞模型：1、选取生长状态良好的H9c2(2-1)细胞株60瓶,随机分为以下6组：(1)普通常氧对照组(Normal):普通DMEM培养基培养48h,置于37℃95%空气,5%CO2中持续培养5h；(2)高胆固醇常氧对照组(HC+Normal):高胆固醇DMEM培养基培养48h,置于37℃95%空气,5%CO2中持续培养5h；(3)高胆固醇缺氧／复氧组(HC+H/R):高胆固醇DMEM培养基培养48h,置于充满95%N2和5%CO2的三气培养箱内缺氧培养3h,然后再转入充满95%空气,5%CO2的常氧培养箱中复氧2h；(4)高胆固醇缺氧后处理组(HC+PosC):高胆固醇DMEM培养基培养48h,缺氧培养3h后,复氧5min+缺氧5min,重复三次,然后再复氧培养1.5h；(5)高胆固醇DMOG+缺氧后处理(HC+DMOG+PostC):高胆固醇DMEM培养基培养48h,缺氧前在培养液中分别加入0.5mM的DMOG,其余操作同(4)；(6)高胆固醇siRNA+缺氧后处理(HC+RNAi+PC):高胆固醇DMEM培养基培养48h,缺氧前利用siRNA技术使培养的心肌细胞HIF-1α基因沉默,其余操作同(4)；2、检测心肌细胞膜的流动性变化来反应高胆固醇细胞造模是否成功,细胞存活率(CCK8法),培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性变化以及Caspase-3活性来反映缺氧／复氧及缺氧后处理对心肌细胞的影响；3、用Western-blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α的蛋白表达水平；4、用real-time PCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1αmRNA的表达水平。结果1、模型的建立1.1高胆固醇饮食喂养10周后大鼠血脂水平升高由于大鼠的高胆固醇血症不会进展为动脉粥样硬化,从而避免了动脉粥样硬化对随后进行的缺血后处理研究的影响,因此本研究采用大鼠来建立食源性高胆固醇血症模型。50只大鼠在高胆固醇饮食喂养前血脂水平无明显差异,将其随机平均分为5组,其中经高胆固醇饮食喂养10周后的四组40只大鼠,其血脂水平显著升高,血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和低密度脂蛋白(LDL)水平均显著高于同期普通饮食喂养的大鼠血脂水平(P<0.05,),说明高胆固醇血症大鼠模型已成功建立。(表1)1.2 HC大鼠缺血/再灌注后心肌梗塞面积1.2.1 ST段的变化心电图Ⅱ导联显示ST段弓背抬高(≥0.15mV),认为缺血成功(图1)。1.2.2危险区面积占左心室面积的百分比(AAR/LV比值)以危险区面积占左心室面积的百分比(即AAR/LV比值)作为判别心肌缺血程度的指标,发现各实验组间的AAR/LV均无显著差异(P>0.05),表明各组动物模型的缺血程度大体相同,因而在此实验模型基础之上的实验结果具有可比性。(图2)1.2.2心肌梗塞面积占危险区面积的百分比(An/AAR比值)心肌梗塞面积不同程度的反应了心肌损伤状况以及心肌损伤易感性。高胆固醇血症大鼠心肌梗塞面积占危险区面积的百分数比伪手术组明显升高(38.36±1.04% vs. 4.15±1.16%,P<0.05)。(图2)以上结果说明高胆固醇血症大鼠及其缺血／再灌注模型造模成功。2.后处理使HC大鼠心肌缺血／再灌注损伤降低2.1后处理使HC大鼠心肌缺血/再灌注后血清中CK活性降低实验采用CK活性做为评价心肌损伤的指标。经CK试剂盒检测可见,高胆固醇血症缺血／再灌注组与高胆固醇Sham组相比,血清CK活性明显增高(0.68±0.15U／mlvs.0.19±0.05U/ml,P＜0.05),而后处理可以降低缺血／再灌注的血清CK活性(0.48±0.11U／mlvs.0.68±0.15U/ml, P＜0.05)(图3)。2.2后处理减少HC大鼠缺血／再灌注诱导的心肌细胞凋亡的影响用DNA原位末端缺口标记法(TUNEL)进行心肌细胞凋亡检测,结果显示：高胆固醇伪手术组(HC+Sham)大鼠心肌组织细胞凋亡指数为(1.96±0.23)%,缺血／再灌注组(HC+MI/R)心肌细胞凋亡指数(15.21±2.47)%明显增高,而后处理(HC+MI/R+PC)与之相比明显降低(9.26±0.94)%,有统计学差异(P<0.05)(图4)。由于TUNEL法检测细胞凋亡具有敏感性高、但特异性较差的特点,因此我们配合检测了缺血／再灌注心肌组织的Caspase-3活性来共同说明心肌细胞的凋亡情况。Caspase-3检测结果显示：与Sham组(1.19±0.20)相比,缺血／再灌注组Caspase-3活性明显增高,达到(4.02±0.59),后处理使之明显降低(2.21±0.24)(P<0.05)(图5)。以上结果提示,后处理可以减轻高胆固醇血症大鼠心肌缺血／再灌注损伤。3、HIF-1α参与了后处理对HC大鼠缺血／再灌注心肌的保护作用3.1 HC大鼠心肌缺血／再灌注及后处理对HIF-1α蛋白表达和mRNA表达的影响在高胆固醇血症大鼠,缺血／再灌注组心肌组织HIF-1α蛋白水平与伪手术组相比明显升高(2.29±0.32 vs. 1.15±0.31,P<0.05)；而后处理又进一步升高(4.07±0.33,P<0.05)(图6)。为进一步阐明高胆固醇血症大鼠缺血／再灌注与后处理上调HIF-1α蛋白水平是否是在基因水平上的调节,我们采用real time-PCR方法测定HIF-1αmRNA水平的表达。结果显示,无论是在高胆固醇血症组还是在正常饮食组,缺血／再灌注与后处理均未影响心肌组织中HIF-1αmRNA水平的表达,各组间HIF-1αmRNA水平无明显差异(图7)。以上结果提示,在高胆固醇血症大鼠,缺血／再灌注增加了心肌组织中HIF-1α蛋白水平的表达,后处理使得HIF-1α的表达更进一步增加,而这种增加均发生在其翻译后水平。3.2HIF-1α的过表达使后处理对HC大鼠缺血／再灌注心肌的保护作用加强3.2.1DMOG明显提高了高胆固醇血症大鼠心肌组织中HIF-1α蛋白的含量,但不影响心肌组织中HIF-1αmRNA水平的表达与单纯缺血／再灌注组相比,给予后处理后高胆固醇血症大鼠心肌组织中HIF-1α蛋白含量显著增加,而给予DMOG后再给予后处理,则更进一步提高了心肌组织HIF-1a的蛋白水平(7.04±0.27vs.2.29.±0.32,P<0.05).(图8)。为了进一步证实DMOG上调HIF-1α表达不是发生在基因水平上的调节,用real time-PCR方法检测了给药前后各组高胆固醇血症大鼠心肌组织中HIF-1αmRNA水平的变化。结果显示,给予DMOG后再后处理组大鼠心肌组织中HIF-1α的mRNA水平与给药前相比均未发生改变。(图9)3.2.2DMOG对后处理减轻HC大鼠缺血／再灌注心肌损伤效应的影响3.2.2.1 DMOG进一步增强了后处理减小缺血／再灌注心肌梗死面积的效应与单纯缺血／再灌注组相比,给予后处理后心肌梗死面积减小,给予DMOG后再给予后处理,进一步减小心梗面积(19.68±1.63%vs.38.36±1.04%,P<0.05)(图10)。3.2.2.2 DMOG使后处理降低血清CK活性的效应进一步加强结果显示,给予DMOG后,后处理组大鼠血清中CK活性与给药前相比均显著降低后处理可以降低缺血／再灌注的血清CK活性(0.34±0.03 U/ml vs.0.68±0.15 U/ml, P＜0.05),与减小心梗面积的效应相同(图11)。3.2.2.3 DMOG进一步提高了后处理降低缺血／再灌注心肌细胞凋亡的作用同减小心梗面积及血清CK活性的效应相同,DMOG使后处理组大鼠心肌组织Caspase-3比活性及心肌细胞凋亡指数显著降低(1.37±0.22 vs.4.02±0.59,P<0.01)(5.71%±0.67% vs. 15.21%±2.48%,P<0.05)(图13,图12-2)。以上结果表明,在后处理之前预先给予DMOG,可以使HIF-1α的表达上调,同时后处理对缺血心肌的保护效应也进一步提高,显示了DMOG与后处理具有叠加效应。由此进一步提示,高胆固醇血症大鼠心肌组织中HIF-1α的蛋白水平增加可能与后处理的心肌保护效应有关。4、高胆固醇H9c2(2-1)细胞模型的建立4.1高胆固醇H9c2(2-1)细胞膜流动性降低与普通H9c2(2-1)相比,高胆固醇H9c2(2-1)细胞膜DPH荧光偏振度(P)和微粘度(η)明显升高(P：0.34±0.07 vs. 0.24±0.05,P<0.01；η：7.99±1.37 vs. 2.41±0.59,P<0.01),说明高胆固醇H9c2(2-1)细胞膜流动性下降(图14)。4.2高胆固醇H9c2(2-1)细胞膜C/P升高与普通H9c2(2-1)细胞相比,高胆固醇H9c2(2-1)细胞膜C/P升高(0.44±0.04 vs.0.33±0.03,P<0.01)(图15)。上述实验发现高胆固醇H9c2(2-1)细胞膜流动性降低以及某些膜蛋白功能活性改变,而这种变化可能是由于高胆固醇H9c2(2-1)细胞膜脂质比例的失调而造成的。说明高胆固醇细胞造模成功。5、后处理对高胆固醇H9c2(2-1)细胞缺氧／复氧损伤的保护作用5.1后处理可以提高高胆固醇H9c2(2-1)细胞存活率将高胆固醇H9c2(2-1)细胞置于含95%N2-5%CO2的低氧环境中培养3h,再置于含95%空气-5%CO2的常氧环境中复氧2h后,细胞存活率降低为常氧培养(其细胞存活率假定为100%)时的52%(P<0.01)；而在复氧前预先给予三个循环的5min复氧+5min缺氧处理后(即后处理),心肌细胞存活率则可上升为常氧培养时的65%(P<0.01)(图16)5.2后处理可以降低高胆固醇H9c2(2-1)细胞LDH活性当心肌细胞受到损伤时,细胞内的乳酸脱氢酶(LDH)释放到培养液中,因此可以通过测定细胞培养液中LDH的活性／漏出量来反映心肌细胞的损伤情况。高胆固醇H9c2(2-1)细胞经受缺氧／复氧后,培养液中LDH活性明显升高,达123.68U/ml(P<0.05);而与缺氧／复氧组相比,后处理则使LDH的漏出量降低到66.12U/ml(P<0.05)(图17)。5.3后处理可以降低高胆固醇H9c2(2-1)细胞Caspase3比活性高胆固醇H9c2(2-1)细胞经受缺氧／复氧后,Caspase3比活性明显升高,达21.86(P<0.05)；而与缺氧／复氧组相比,后处理则使Caspase3比活性降低到5.51(P<0.05)(图18)。6. HIF-1α参与了后处理对高胆固醇H9c2(2-1)细胞缺氧／复氧的保护作用在高胆固醇H9c2(2-1)细胞,缺氧／复氧组HIF-1α蛋白水平与常氧组相比明显升高(2.12.±0.40 vs. 1.22±0.23,P<0.05)；而后处理使之又进一步升高(4.85±0.44)(图19)。用realtime-PCR方法测定HIF-1αmRNA水平的表达,结果显示,在缺氧／复氧与后处理均未影响高胆固醇H9c2(2-1)细胞中HIF-1αmRNA水平的表达,各组间HIF-1αmRNA水平无明显差异(图20)。6.1HIF-1α的过表达使后处理对高胆固醇H9c2(2-1)细胞缺氧／复氧损伤的保护作用加强6.1.1DMOG使高胆固醇H9c2(2-1)细胞中HIF-1α表达水平增高,但不影响HIF-1αmRNA水平的表达与单纯缺氧／复氧组相比,给予后处理后高胆固醇H9c2(2-1)细胞中HIF-1α蛋白含量显著增加,而给予DMOG后再给予后处理,则更进一步提高了HIF-1α的蛋白水平(6.94±0.70vs. 2.11.±0.40,P<0.05)(图21)。为了进一步证实DMOG上调HIF-1α表达不是发生在基因水平上的调节,用realtime-PCR方法检测了给药前后各组细胞中HIF-1αmRNA水平的变化。结果显示,给予DMOG后再给予后处理组细胞中HIF-1α的mRNA水平与给药前相比均未发生改变(图22)。6.1.2DMOG对后处理减轻缺氧／复氧致心肌细胞损伤效应的影响6.1.2.1 DMOG进一步增强了后处理减小缺氧／复氧致细胞存活率的降低与单纯缺氧／复氧组相比,给予后处理后高胆固醇H9c2(2-1)细胞的存活率升高,给予DMOG后再给予后处理,进一步增加了细胞的存活率(81.67±6.34%vs.51.83±4.62%,P<0.05)(图23)。6.1.2.2 DMOG使后处理降低LDH活性的效应进一步加强结果显示,后处理可以降低缺氧／复氧组心肌细胞的LDH活性,而给予DMOG后，后处理组细胞LDH活性与给药前相比显著降低(54.72±3.20 U/ml vs.66.17±3.09 U/ml,P<0.05)(图24)。6.1.2.3 DMOG进一步提高了后处理降低缺氧／复氧高胆固醇H9c2(2-1)细胞凋亡的作用DMOG使后处理组高胆固醇H9c2(2-1)细胞Caspase-3比活性显著降低(2.79±0.741 vs.21.86±2.80,P<0.05)(图25)。以上结果表明,在后处理之前预先给予DMOG可以使HIF-1α的表达上调,同时后处理对缺氧细胞的保护效应也进一步提高。由此进一步提示,高胆固醇H9c2(2-1)细胞中HIF-1α的蛋白水平可能与后处理的心肌保护效应有关。6.2HIF-1α的基因沉默使后处理对细胞的保护作用降低6.2.1高胆固醇H9c2(2-1)细胞HIF-1α基因沉默模型的建立在常氧情况下,高胆固醇H9c2(2-1)细胞中HIF-1α呈低水平表达,而进行基因沉默后HIF-1α的表达水平显著降低(0.244±0.14 vs.0.91±0.20,P<0.05)(图26)；基因沉默后HIF-1α的mRNA水平也降低(0.19±0.16 vs.27±0.27,P<0.05)(图27)。以上结果说明,HIF-1α基因沉默在高胆固醇H9c2(2-1)细胞上的模型建立成功。6.2.2HIF-1α基因沉默对后处理减轻缺氧／复氧心肌细胞损伤效应的影响6.2.2.1 HIF-1α基因沉默减弱了后处理减小缺氧／复氧致细胞存活率的降低与单纯缺氧／复氧组相比,给予后处理后高胆固醇H9c2(2-1)细胞的存活率升高,但是预先使HIF-1α基因沉默后再后处理,则使细胞的存活率显著降低(57.40±4.83%,P<0.05)(图28)。6.2.2.2 HIF-1α基因沉默使后处理降低LDH活性的效应减弱结果显示,后处理可以降低缺氧／复氧组心肌细胞LDH活性,而使HIF-1α基因沉默后,后处理组细胞LDH活性与基因沉默前相比显著升高(80.29±3.76U／ml,P<0.05)(图29)。6.2.2.3 HIF-1α基因沉默使后处理降低缺氧／复氧高胆固醇H9c2(2-1)细胞凋亡的作用下降HIF-1α基因沉默使后处理组高胆固醇H9c2(2-1)细胞Caspase-3比活性升高显著(11.62±1.84,P<0.05)(图30)。以上结果表明,在后处理之前预先给予使HIF-1α基因沉默,在使HIF-1α的表达降低的同时,后处理对缺氧细胞的保护效应也下降。由此进一步提示,高胆固醇H9c2(2-1)细胞中HIF-1α的蛋白水平可能与后处理的心肌保护效应有关。结论1、后处理可以减轻高胆固醇血症大鼠缺血／再灌注造成的心肌损伤；2、HIF-1α的表达上调参与了后处理对高胆固醇血症大鼠心肌缺血／再灌注导致的心肌损伤的保护作用。

低氧诱导因子-1α在后处理保护高胆固醇血症大鼠缺血心肌中的作用

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