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核酸修饰酶检测的新型生物传感器研究

作　者: 柳书成
导　师: 俞汝勤
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 电化学生物传感器化学发光生物传感器 DNA甲基化转酶 DNA酶酶活性检测糖基化酶
分类号: TP212.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

酶是一类生物催化剂。生命体内含有成千上百种蛋白质酶，它们的活性与生命体的生长、发育、新陈代谢等许多过程密切相关。大多数生命体由细胞构成，细胞的整个生命活动过程都有其体内的酶活性息息相关，只有保持酶的活性，细胞才能不断的发育和繁殖下去。当细胞中的酶失活性后，其生命过程也将结束。人类的许多生命体的疾病，很多都也与酶活性相关。因此，对生命体中重要酶的活性的检测以及其抑制剂的筛选很有研究意义。基于电化学分析法、化学发光分析法、荧光分析法，发展了一些低成本、简捷快速、具有特异的选择性和高灵度的生物传感器，检测人体内DNA核酸修饰酶活性。基于DNA甲基化敏感性限制性内切酶和末端转移酶的电化学生物传感器用于DNA甲基化转移酶活性的灵敏检测。主要内容包括：在第2章中，构建了一种灵敏的电化学传感器对DNA甲基化转移酶活性检测和对影响DNA甲基化转移酶活性作用的抑制剂筛选。本电化学DNA生物传感器基于甲基化敏感的限制性内切酶活性对特异性甲基化DNA序列的识别，利用末端转移酶的活性对末端碱基的延伸，从而达到对DNA甲基化转移酶活性的检测。该电化学生物传感器检测下限可达到0.04U/mL。在第3章中，设计了一条双链DNA探针，DNA糖基化酶hOGG1能特异性识别设计好的双链DNA，将受损的碱基8-oxo-dG从DNA序列中移除，产生一个新的5’磷酸端的缺口，由于缺口的产生，较短的DNA熔链温度变得低就会从互补链解链下来，形成具有新的5’磷酸端的双链DNA。由于Lambda外切酶能消化5’磷酸端的双链DNA，血红素核酸适体的互补链被消化分解释放出来，与血红素结合形成G四股螺旋结构的复合物，而这种复合物是具有辣根过氧化物酶的催化活性的DNAzyme，在有双氧水的情况下，将无色底物2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS2-）转化为绿色的ABTS-，这样就可以能通过极其简单的比色就能达到对hOGG1酶活性的检测。该方法的检测下限可达到0.01U/mL。在第4章中，基于Nick切刻酶等温循环和Mg²⁺的DNAymze切刻循放大环荧光信号用于DNA糖基化酶的灵敏检测。设计了一条DNA双链探针选择性识别hOGG1形成发夹结构，通过Nick酶切刻和DNA聚合酶作用于发夹结构。在常温条件下实现等温循环，产生大量Mg²⁺的DNAymze。体系中荧光淬灭的分子信标能被Mg²⁺的DNAymze水解，实现荧光增强，水解后Mg²⁺的DNAymze能够被解离，从而再作用其它分子信标达到循环作用。通过这两步循环的放大过程，分子信标荧光的恢复，从而达到对hOGG1酶活性的灵敏检测。该方法的检测下限可达到0.17U/mL。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第1章绪论  12-24
  1.1 生物传感器  12-14
    1.1.1 生物传感器的基本结构与工作原理  12-13
    1.1.2 生物传感器的分类  13
    1.1.3 生物传感器的优点  13-14
    1.1.4 生物传感器的应用与前景  14
  1.2 电化学生物传感器  14-16
    1.2.1 电化学生物传感器的原理  14-15
    1.2.2 电化学生物传感器的分类  15-16
  1.3 电化学生物传感器电极表面的生物材料固定方法  16-18
    1.3.1 吸附法  17
    1.3.2 包埋法  17
    1.3.3 共价键合法  17
    1.3.4 化学交联法  17
    1.3.5 电化学聚合法  17-18
    1.3.6 聚电解质静电吸附组装技术  18
    1.3.7 纳米材料固定技术  18
  1.4 光学生物传感器  18-21
    1.4.1 光学生物传感器的原理  19
    1.4.2 光学生物传感器的优点与常见光学生物传感器  19
    1.4.3 荧光生物传感器  19-20
    1.4.4 化学发光生物传感器  20-21
  1.5 功能核酸  21-23
    1.5.1 核酸适配体  21-22
    1.5.2 DNA 酶  22-23
  1.6 论文构想  23-24
第2章基于 DNA 甲基化敏感性限制性内切酶和末端转移酶的电化学生物传感器用于 DNA 甲基化转移酶活性的灵敏检测  24-34
  2.1 前言  24-25
  2.2 实验  25-27
    2.2.1 试剂与仪器  25-26
    2.2.2 传感器界面处理  26
    2.2.3 检测 DamMTase活性  26-27
    2.2.4 Dam MTase 的抑制剂影响测定  27
  2.3 结果与讨论  27-32
    2.3.1 实验原理  27-29
    2.3.2 传感器的阻抗大小测定  29
    2.3.3 Dam MTase 作用时间的优化  29-30
    2.3.4 末端转移酶作用时间的优化  30-31
    2.3.5 Dam MTase 活性的检测  31-32
    2.3.6 抑制剂 5-FU 对DamMTase活性的影响  32
  2.4 小结  32-34
第3章基于 Lambda 外切酶和 DNAzyme 催化显色用于 DNA 糖基化酶的灵敏检测  34-43
  3.1 前言  34-35
  3.2 实验部分  35-36
    3.2.1 实验试剂与仪器  35-36
    3.2.2 hOGG1 活性的检测  36
    3.2.3 电泳凝胶色谱法测定 hOGG1 酶的活性  36
  3.3 结果与讨论  36-42
    3.3.1 实验原理  36-39
    3.3.2 酶作用时间优化  39
    3.3.3 Lambda 外切酶浓度的优化  39-40
    3.3.4 hOGG1 活性检测  40-41
    3.3.5 传感器的选择性考察  41-42
  3.4 小结  42-43
第4章基于切刻酶等温循环和 Mg~(2+)的核酸 DNA 酶切刻循环放大荧光信号用于DNA 糖基化酶的灵敏检测  43-50
  4.1 前言  43-44
  4.2 实验部分  44-45
    4.2.1 实验试剂与仪器  44-45
    4.2.2 DNA 糖基化酶 hOGG1 活性的检测  45
  4.3 实验结果与讨论  45-49
    4.3.1 实验原理  45-46
    4.3.2 DNA 酶作用时间考察  46-47
    4.3.3 分子信标浓度考察  47
    4.3.4 Mg_(2+)浓度考察  47-48
    4.3.5 hOGG1 酶活性的检测  48-49
  4.4 小结  49-50
结论  50-52
参考文献  52-61
附录 A 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  61-62
致谢  62

核酸修饰酶检测的新型生物传感器研究

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