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人脂肪干细胞在纳米细菌纤维素膜上成骨分化的实验研究

作　者: 卓奇
导　师: 叶启彬
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 脂肪干细胞细菌纤维素骨组织工程种子细胞生物材料支架成骨诱导
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究目的通过研究hASCs和BC膜的生物相容性,以及前者向成骨方向诱导分化的特性来初步探讨hASCs和BC作为骨组织工程种子细胞和支架材料的可行性。研究方法1. hASCs传代培养；2.扫描电镜(SEM)观察BC膜超微结构；3.倒置显微镜观察hASCs的生长形态特征；4. CCK-8检测hASCs在BC膜上的增殖；5.冰冻切片/HE染色,及SEM观察hASCs在BC膜上的粘附；6.倒置显微镜观察hASCs成骨诱导分化过程中的生长形态特征；7. Von Kossa染色、茜素红染色、碱性磷酸酶(ALP)染色检测hASCs的成骨诱导分化；8. RT-PCR检测hASCs在不同培养条件下成骨诱导分化中成骨标志物Osteopontin (OPN)、Osteocalcin(OC)、和ALP的表达产物,电泳后测条带灰度,计算OC/GAPDH、OPN/GAPDH和ALP/GAPDH灰度的比值代表以上基因的相对表达量；9.分别比较OPN、OC、ALP基因在不同培养条件下的表达差异；分析上述三种基因表达相互之间的联系。研究结果1.大体上BC膜呈乳白色半透明胶状,外表均匀光滑；扫描电镜下可见细菌纤维素膜呈超微细网状结构,呈现出良好的纳米纤维网络特征；2. hASCs在细菌纤维素膜表面贴附后呈长梭形,随着时间延长,细菌纤维素膜表面细胞数量逐渐增多,形态仍然保持长梭形。到9d时细胞融合成片；3. hASCs-BC膜复合培养物冰冻切片及HE染色可见细胞呈续的单层贴附生长于细菌纤维素膜表面,接触紧密,且未见hASCs长入材料内部；4.扫描电镜观察可见hASCs呈长梭形,边缘伸出突触,贴附于细菌纤维素膜生长；5. hASCs在细菌纤维素膜表面的增殖良好,细胞对数生长期约在3-9天；6.脂肪间质干细胞成骨分化过程中刚贴壁时仍呈长梭形或椭圆形,之后细胞形态逐渐开始出现短梭形和多角形等。随着诱导时间的延长,由梭形变为立方形、锥形,并有明显胞浆突出,出现多角形成骨样细胞,胞质颜色变深,含粗大颗粒,胞核明显从胞浆伸出许多丝状伪足,并可见明显不透光矿化结节；7.在诱导培养基的条件下,细胞von Kossa染色hASCs在细胞培养板和BC膜上均呈现阳性反应,细胞内大可见量的黑色的矿化物质存在。普通干细胞培养基培养的条件下均呈阴性反应。且同样培养基条件下组间大体上无明显差异；8.在诱导培养基的条件下,细胞茜素红染色hASCs在细胞培养板和BC膜上均呈现阳性反应,可见大量的呈现桔红色的钙沉积阳性细胞。普通干细胞培养基培养的条件下均呈阴性反应。且同样培养基条件下组间大体上无明显差异；9.在诱导培养基的条件下,ALP染色hASCs在细胞培养板和BC膜上均呈现阳性反应,可见明显的染成蓝黑色的胞浆,细胞核为深蓝色。普通干细胞培养基培养的条件下BC膜组细胞胞浆似见较弱的蓝染；10.RT-PCR检测成骨相关基因表达结果显示：第2周(依次为：0.89±0.09；0.72±0.12：0.43±0.06：0.47±0.05)和第4周(依次为：1.51±0.10；1.47±0.12；1.20±0.15；1.18±0.09)所有细胞均有ALP表达,但成骨诱导分化组明显高于普通培养基组(P<0.001)。OC和OPN在第2周均无明显表达,在第4周OPN有较明显的表达(依次为：0.51±0.09；0.48±0.07；0.11±0.030.10±0.02),OC微弱表达(依次为：0.33±0.09；0.30±0.12；0.12±0.06；0.10+0.05)且同样培养基条件下组间无明显统计学差异(P>0.05)；11.成骨诱导过程中OC、OPN和ALP表达之间存在较强的正相关性(分别为：r=0.998,P=0.002；r=0.959,P=0.04；r=0.965,P=0.04)。研究结论1.细菌纤维素膜具有独特的纳米超微结构,hASCs能在其表面良好的增殖和贴附,具有良好的生物相容性；2.利用含抗坏血酸、 β—甘油磷酸和地塞米松的诱导培养基能将hASCs在普通细胞平板上成功的进行成骨诱导分化；3.利用含抗坏血酸、β—甘油磷酸和地塞米松的诱导培养基能将hASCs在细胞纤维素膜上成功的进行成骨诱导分化；4.成骨诱导过程中,hASCs形态发生明显转变；5.成骨诱导过程中,ALP、OPN、OC有着明显的时间表达特征；6.成骨诱导过程中,成骨标志物OC、OPN和ALP表达之间存在较强的正相关性；7. hASCs的成骨分化在细胞培养平板和细菌纤维素膜上没有明显统计学差异。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-12
实验第一部分  12-24
  1材料与方法  12-16
  2结果  16-22
  3讨论  22
  4结论  22-23
  参考文献  23-24
实验第二部分  24-74
  第一节hASCs在BC膜上成骨分化细胞水平层面的研究  24-39
    1材料与方法  24-30
    2结果  30-39
  第二节脂肪干细胞在细菌纤维素膜表面成骨分化相关基因表达的初步研究  39-68
    1材料和方法  39-48
    2结果  48-68
  第二部分实验讨论  68-72
  第二部分实验结论  72-73
  参考文献  73-74
文献综述  74-82
  参考文献  78-82
致谢  82

人脂肪干细胞在纳米细菌纤维素膜上成骨分化的实验研究

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