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纳米羟基磷灰石介导p53基因抗肿瘤的研究

作　者: 须苏菊
导　师: 孔祥东
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 纳米羟基磷灰石 癌症基因治疗 p53基因 转染
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


羟基磷灰石是一种由钙离子、磷酸根离子、羟基组成的磷酸钙复合物，分子式为Ca10（OH）2（PO4）6，它是构成天然骨、牙的主要成分。羟基磷灰石具有良好的生物活性和生物相容性。其中，纳米尺度的羟基磷灰石对肿瘤细胞的生长有遏制作用，而对正常细胞基本无毒副作用。纳米粒子通过细胞吞噬作用进入细胞；同时，羟基磷灰石颗粒在癌细胞偏酸性环境中发生降解释放出携带的目的基因。因此，纳米羟基磷灰石可以作为一种新型的无机非病毒癌症基因治疗载体。本研究中，首次将纳米羟基磷灰石颗粒用作介导p53基因转染癌细胞的基因治疗载体。首先试验设计、合成了三种不同粒径的纳米HAp颗粒（L-HAp，M-HAp，S-HAp），平均粒径分别为3.8μm，141nm，39nm。该三种颗粒均为球型，且表面电位相同。其次，将反转录得到的p53基因构建到真核表达载体pEGFP-C1（表达绿色荧光蛋白）上，构成重组质粒pEGFP-C1-p53（表达GFP-P53融合蛋白）。然后，将上述两者在一定条件下温浴、复合形成HAp-pEGFP-C1-p53复合物。最后，分别体外转染人癌细胞A549，Huh7，HeLa和人正常细胞QSG-7701，Beas-2B，从细胞生物学水平评价纳米HAp颗粒作为癌症基因治疗载体的安全性和有效性。本试验中合成的三种不同粒径的纳米HAp颗粒均能介导p53基因转染癌细胞，表达相应的蛋白。流式细胞仪检测结果显示纳米HAp颗粒可以转染5%-10%的癌细胞；而转染正常细胞的效率约为0.5%，即几乎不能转染正常细胞或转染正常细胞后几乎不能表达GFP-P53融合蛋白；其中M-HAp的转染效率略高于L-HAp和S-HAp。HAp-pEGFP-C1-p53复合物转染癌细胞后可以诱导癌细胞凋亡，对癌细胞的杀伤效果达到80%以上。MTT实验和结晶紫染色结果显示，纳米HAp颗粒对正常细胞没有明显的细胞毒性，具有较好的生物相容性。综上结果，本研究为纳米HAp颗粒作为安全有效的无机非病毒基因治疗载体系统和进一步完善基因载体设计提供了理论依据。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-9
缩略语表  9-10
第一章 绪论  10-24
  1.1 引言  10-11
  1.2 基因治疗载体  11-16
    1.2.1 病毒载体系统  12-14
    1.2.2 非病毒载体系统  14-16
  1.3 羟基磷灰石作为基因治疗载体的国内外研究现状  16-21
    1.3.1 HAp 的理化性质  17
    1.3.2 HAp 的转染机制  17-19
    1.3.3 纳米 HAp 作为基因治疗载体的优势  19-21
  1.4 p53 抑癌基因  21-22
  1.5 本课题研究内容  22-24
第二章 纳米羟基磷灰石的制备  24-34
  2.1 引言  24
  2.2 实验部分  24-30
    2.2.1 实验材料与仪器  24-26
    2.2.2 三种 HAp 的制备方法  26-29
    2.2.3 材料表征方法  29-30
  2.3 结果与分析  30-33
  2.4 本章小结  33-34
第三章 重组质粒 pEGFP-C1-p53 的构建  34-46
  3.1 引言  34
  3.2 实验部分  34-42
    3.2.1 实验材料与仪器  34-37
    3.2.2 p53 基因的获得  37-38
    3.2.3 重组质粒 pEGFP-C1-p53 的鉴定  38-42
  3.3 结果与分析  42-45
    3.3.1 重组质粒构建  42-43
    3.3.2 获得 p53 基因  43-44
    3.3.3 重组质粒 pEGFP-C1-p53 的鉴定  44-45
  3.4 本章小结  45-46
第四章 载体-基因复合  46-52
  4.1 引言  46
  4.2 实验部分  46-48
    4.2.1 实验材料与仪器  46-47
    4.2.2 载体-基因复合  47-48
    4.2.3 不同 pH 下载体-基因的解离试验  48
  4.3 结果与分析  48-51
    4.3.1 载体-基因复合试验结果  48-49
    4.3.2 不同 pH 下载体-基因解离试验结果  49-51
  4.4 本章小结  51-52
第五章 体外转染试验  52-72
  5.1 引言  52
  5.2 实验部分  52-62
    5.2.1 实验材料与仪器  52-56
    5.2.2 钙离子探针检测纳米 HAp 颗粒细胞内降解试验  56-57
    5.2.3 荧光显微镜观察 GFP-P53 蛋白表达  57
    5.2.4 流式细胞仪检测三种纳米 HAp 颗粒的转染效率  57-58
    5.2.5 三种纳米 HAp 颗粒的安全性评价  58
    5.2.6 三种纳米 HAp 颗粒介导 pEGFP-C1-p53 抗肿瘤的试验  58-59
    5.2.7 融合蛋白 GFP-P53 在肿瘤细胞中表达水平的检测  59-62
    5.2.8 统计学分析  62
  5.3 结果与分析  62-71
    5.3.1 钙离子探针检测纳米 HAp 颗粒细胞内降解试验结果  62-63
    5.3.2 荧光显微镜观察 GFP-P53 蛋白表达结果  63-64
    5.3.4 流式细胞仪检测三种 HAp 转染效率结果  64-67
    5.3.5 三种纳米 HAp 颗粒的安全性评价  67-70
    5.3.6 三种纳米 HAp 颗粒介导 pEGFP-C1-p53 抗肿瘤的试验结果  70
    5.3.7 融合蛋白 GFP-P53 在肿瘤细胞中表达水平的检测  70-71
  5.4 本章小结  71-72
第六章 结论  72-74
参考文献  74-80
硕士期间论文发表情况  80-81
致谢  81

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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