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毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究

作　者: 王瑶
导　师: 付小兵
学　校: 南开大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 毛囊干细胞汗腺细胞再生诱导分化组织工程皮肤
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

干细胞(stem cells)维持着生命体组织器官的发生发展以及损伤的修复与再生,随着近年来再生医学的迅猛发展,干细胞治疗在临床中的应用日益广泛,疗效显著,已成为很多难治性疾病的终极治疗手段,干细胞的研究已经成为全国乃至全世界的研究热点。在下文中我们将以毛囊干细胞这一成体干细胞为研究主体,对其生物学特性及其在再生医学中的应用进行研究实验,以期证明毛囊干细胞为再生医学干细胞治疗的理想干细胞源。实验目的：1.体外分离培养并扩增毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSCs),建立一种快速高效的细胞培养体系,为后续试验奠定基础；2.通过体外诱导实验,将HFSCs定向诱导为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞,验证HFSCs的多分化潜能；3.证实HFSCs经过特殊共培养体系诱导后,可以分化为汗腺样细胞(sweat gland cells,SGCs),并可参与汗腺(sweat gland,SG)的修复与再生；4.以HFSCs为种子细胞构建结构和功能更趋于完整的组织工程全层皮肤。实验方法：1.分别用“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种方法体外分离HFSCs,并将毛囊组织或细胞植入铺有IV型胶原,以丝裂霉素C处理过的成纤维细胞为饲养层的transwell双层细胞培养板中,观察对比两组中细胞的形态、生长特性、及体外扩增能力的异同,并通过CD200、CD29、CK15等HFSCs特异性标记物的免疫细胞化学染色、免疫细胞荧光染色及流式细胞技术,分析、鉴定分离培养的HFSCs;2.分别建立两种不同的体外细胞诱导体系,将HFSCs分别诱导分化为皮脂腺细胞、表皮细胞,并通过皮脂腺细胞及表皮细胞特异性标记物的免疫细胞化学、免疫细胞荧光染色及脂质的油红O染色,对诱导后细胞进行表型分析与鉴定；3.体外分离培养人手掌或脚掌来源的SGCs及真皮间充质干细胞(dermal mesenchymal stem cells,d-MSCs),利用transwell细胞培养板建立了一种特殊的HFSCs共培养体系,主要由热休克的SGCs及一种仿真皮结构的间质组织构成,我们又称之为间质饲养层(mesenchymal feeder layer, M-FL)主要包括d-MSCs、 Matrigel基质胶以及一定比例的优质胎牛血清(FBS),同时设立两个对照组,对照组1中不包含热休克SGCs,对照组2中不包含M-FL；细胞经过诱导后,应用免疫细胞化学,免疫细胞荧光染色及流式细胞技术对诱导后细胞进行SGCs表型鉴定,对比实验组、对照组1、对照组2中细胞的表型变化情况,同时,通过台盼蓝拒染实验观察各组细胞的生长活性,Edu(5’-ethynyl-2’-deoxyuridine)标记技术对比分析各组中细胞的增殖能力；4.体外建立裸鼠脚掌烫伤模型,将HFSCs诱导来源的汗腺样细胞(induced-sweat gland cells, i-SGCs)移植到裸鼠脚掌的烫伤部观察,并以等量Nacl注射作为对照组,4周后,愈合创面全层皮肤取材,汗腺特异性标记物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、细胞角蛋白14(cytokeratin14, CK14)的免疫组化及免疫荧光染色分析判断,观察接受细胞移植的创面皮肤中是否有新生的汗腺结构存在；5.蛋白印迹法(western bolt)、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR)检测分析HFSCs诱导前、后的外胚层发育不良(ectodermal dysplasia,EDA)基因及其受体(ectodermal dysplasia receptor,EDAR)的基因及蛋白表达的变化,以进一步探索HFSCs分化为SGCs的分子机制；6.分别以HFSCs (A组),表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)(B组)为种子细胞体外建立组织工程学全层皮肤,通过伊红-苏木素(hematoxylin-eosin staining, HE)染色分析两组标本形态结构的异同,观察A组标本中是否有毛囊样结构形成；两组标本分别进行integrin β1(CD29)、细胞角蛋白19(cytokeratin19, CK19)免疫组织化学染色,观察阳性细胞分布多少及分布区域。实验结果：1.“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种细胞分离方法对比结果显示：应用前一种方法培养的第一代细胞生长至80-90%融合的时间为13～14天,而后一种方法为8～9天,但是传代后,从第二代细胞开始,两组细胞的生长速度及增殖能力无明显差异,无统计学意义(p>0.05)2.经过特异性微环境的诱导,HFSCs分别被诱导分化为上皮膜抗原(EMA)及油红染色阳性的皮脂腺细胞,以及细胞角蛋白10(cytokeratin10, CK10)阳性的角质形成细胞；3.在HFSCs汗腺化诱导实验中,实验组中,有一部分HFSCs最终被定向诱导分化成为具有汗腺表型的细胞,对比之下,对照组1中没有细胞分化为SGCs.对照组2中只有极少部分细胞发生了向SGCs的转化；我们利用细胞的特异性标记物,通过免疫荧光染色及流式细胞技术鉴定诱导后细胞,发现在这些细胞中HFSCs特异性标记物CD200、CD29及CK15的表达变弱了,而汗腺细胞特异性标记物CEA和CK14的表达却增强了,这说明HFSCs在设计的共培养微环境中可以实现向SGCs的分化；4. western blot结果显示分化而来的SGCs高表达EDA和EDAR,RT-PCR及实时荧光定量PCR分析显示EDA基因及EDAR基因在诱导后SGCs中呈高表达状态；而CD29、CD200等HFSCs特异性抗原基因在汗腺化诱导后表达降低；5.在随后的细胞移植实验中,接受了细胞注射的裸鼠烫伤脚掌的愈合创面,我们发现了类似SG的新生结构,进而行SGCs特异性标记物的免疫组织化学染色及免疫荧光染色,结果显示这些类似汗腺的结构对CEA、CK14呈阳性表达,而在Nacl注射组的创面标本中,没有发现这种类汗腺结构的存在。6.在以HFSCs为种子细胞的A组及以ESCs为种子细胞的B组标本中,HE染色结果显示,两组标本均由表皮和真皮组成,二者之间以基底层相连接,基底层细胞排列较为整齐,细胞偏大,有CK19+和CD29+细胞散在分布；两组间标本对比显示：A组标本中,表皮层相对于B组较厚,分层较多,而且部分标本在基底层下方有毛囊样结构形成,表皮与真皮结合较紧密；B组标本对比A组来说,表皮层较薄,分层较少,表皮真皮易分离,基底层附近CK19+和CD29+阳性细胞较A组标本少,基底层下浅真皮层中无毛囊样结构形成实验结论：1. HFSCs可以在体外适宜的微环境中被分离、培养、扩增；其中“酶消化-毛囊剥离-酶消化”法较“酶消化-毛囊剥离-直接种植”法缩短了原代细胞的培养时间,在实验中更具优势；2. HFSCs具有多分化潜能,可以在体外被诱导分化为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞；3. HFSCs可以在适宜的微环境中,被诱导分化为SGCs; HFSCs作为一种成体干细胞,有用于治疗汗腺缺失的潜能；我们建立的共培养诱导体系可以有效的将HFSCs定向诱导分化为SGCs,其分子机制与EDA/EDAR基因的激活有关；诱导分化而来的汗腺细胞是有功能的,可以参与皮肤创面中汗腺的再生；4.以HFSCs为种子细胞有望构建出富含皮肤附属器的,形态、结构、功能更趋于完善的组织工程全层皮肤。

全文目录

中文摘要  5-9
Abstract  9-18
前言  18-20
第一章文献回顾  20-48
  第一节毛囊干细胞的研究现状  20-29
  第二节汗腺研究概况  29-38
  第三节再生医学研究进展  38-48
第二章研究内容  48-127
  第一节人毛囊干细胞的分离培养与鉴定  48-64
    1. 材料  48-50
    2. 实验方法  50-54
    3. 实验结果  54-61
    4. 讨论  61-64
  第二节毛囊干细胞的多分化潜能  64-72
    1. 材料  64-66
    2. 实验方法  66-69
    3. 实验结果  69-70
    4. 结论  70
    5. 讨论  70-72
  第三节毛囊干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的实验研究  72-93
    1. 材料  73-75
    2. 实验方法  75-81
    3. 实验结果  81-89
    4. 结论  89
    5. 讨论  89-93
  第四节毛囊干细胞体外分化为汗腺样细胞的分子机制初探  93-105
    1. 材料  93-95
    2. 试验方法  95-101
    3. 实验结果  101-103
    4. 结论  103
    5. 讨论  103-105
  第五节毛囊干细胞分化来源的汗腺样细胞在汗腺再生中的作用  105-113
    1. 材料  105-107
    2. 实验方法  107-110
    3. 实验结果  110-111
    4. 结论  111
    5. 讨论  111-113
  第六节毛囊干细胞在组织工程皮肤中的应用  113-127
    1. 材料  114-116
    2. 实验方法  116-120
    3. 实验结果  120-124
    4. 结论  124
    5. 讨论  124-127
参考文献  127-138
致谢  138-139
个人简历  139-140
在读期间发表的学术论文及研究成果  140
课题资助  140

毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究

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