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TiO₂纳米管微沟槽影响MSCs的定向分化的研究

作　者: 钦威
导　师: 杨苹
学　校: 西南交通大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 光刻蚀技术阳极氧化 TiO2纳米管微纳多级结构诱导间充质干细胞
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

当前作为治疗心血管疾病而植入的医疗器械均会不同程度的导致血管内膜的损伤,从而诱发血管再狭窄的可能性。因此研究植入性材料表面快速促进内皮恢复的功能化改进成为热点,近年来随着人们对材料定向调控诱导干细胞分化方面研究的深入,发现具备多功能分化潜性的间充质干细胞(MSC)可以经过体外调控诱导分化为血管细胞,因此借用组织工程学的原理和方法,来探讨生物材料是否也具有定向诱导MSC分化为血管内皮细胞就有了一定的研究意义。本论文将综合利用光刻蚀技术和两次阳极氧化技术制备出的拓扑结构微沟槽二氧化钛纳米管(NANO-TOPO)作为实验样品,同时将利用光刻蚀技术和单次阳极氧化制备的沟槽图形化二氧化钛纳米管(NANO-GRO)样品、单纯阳级氧化制备的二氧化钛纳米管(NANO)样品以及未做任何表面修饰的平板钛(Ti)样品作为实验的对照样来研究各组样品对干细胞(MSC)的调控作用。对于制备出的各组样品本文分别采用了扫描电镜(SEM)、红外图谱分析(FTIR)、X射线衍射(XRD)以及接触角测量等多种材料学表征手段进行分析,结果显示制备的样品沟槽图形尺寸为沟20μm,脊10μm,纳米管尺寸70nm左右,样品晶型结构为锐钛矿相,确保了制备出的样品满足实验内容要求。而作为种子细胞的MSC取自不满4周龄SD大鼠,且经过密度梯度离心法获得,为了保证种子细胞的纯度,对提取的MSC分别进行了干细胞表型鉴定,CD44因子检测结果符合实验要求。短期细胞实验表明,拓扑结构微沟槽二氧化钛纳米管(NANO-TOPO)不仅具有调控干细胞生长取向的作用,而且可以使MSC的生长形态发生极化趋势,且细胞多层生长以后这种趋势不会丧失。这可能与纳米管的管径尺寸以及沟槽结构形貌相关。长期诱导实验结果表明,拓扑结构微沟槽二氧化钛纳米管(NANO-TOPO)不仅可以调控MSC的生长形态,而且可以有效的控制其分化方向,本文先后对分化末端的细胞进行多次鉴定,依次排除了诱导成神经突触细胞、成骨细胞、内皮细胞等的可能性,最终经过6周培养后的细胞表达了平滑肌细胞的特有标记物a-SMA和CNN-1,这样初步表明了构建的这种拓扑结构微沟槽二氧化钛纳米管(NANO-TOPO)可以初步实现调控MSC定向分化为类平滑肌细胞的可能性。因为平滑肌细胞作为天然血管的有机构成的一部分,对血管内皮细胞起到很重要的支持作用,因此,本实验的研究成果为血管内皮化的仿生功能的构建提供了一个有效的载体,为下一步研究做好了铺垫。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
目录  10-13
第1章绪论  13-33
  1.1 引言  13-14
  1.2 组织诱导再生类型  14-17
    1.2.1 仅有成熟体细胞参与的类型  14-15
    1.2.2 成熟体细胞与干细胞同时参与的类型  15-16
    1.2.3 胚胎干细胞参与的类型  16-17
  1.3 干细胞分化过程的基础研究  17-20
    1.3.1 干细胞分化过程的跟踪  17-18
    1.3.2 干细胞增殖和分化的调控  18-20
  1.4 生物诱导干细胞材料体系  20-30
    1.4.1 生物材料表面生物化学改性  20-21
    1.4.2 材料的本身构成和其表而物理特性  21-22
    1.4.3 材料表面微图形化  22-24
    1.4.4 纳米图案化结构的调控  24-30
  1.5 本课题的研究意义,目标内容以及技术路线  30-33
    1.5.1 本课题的研究意义  31
    1.5.2 本课题研究目标和内容  31-32
    1.5.3 技术路线  32-33
第2章 TiO2纳米管微沟槽的制备及表征  33-50
  2.1 引言  33-34
  2.2 实验试剂及仪器  34-35
    2.2.1 实验试剂  34
    2.2.2 实验仪器  34-35
  2.3 样品制备  35-39
    2.3.1 平板钛(Ti)样品的制备  35
    2.3.2 二氧化钛纳米管(NANO)的制备  35-36
    2.3.3 沟槽图形化二氧化钛纳米管(NANO-GRO)的制备  36-38
    2.3.4 拓扑结构微沟槽二氧化钛纳米管(NANO-TOPO)的制备  38-39
  2.4 样品表征  39-42
    2.4.1 光学显微镜(OM)  39-40
    2.4.2 扫描电子显微镜(SEM)  40
    2.4.3 X射线衍射(XRD)  40
    2.4.4 傅里叶转换红外光谱(FTIR)  40-41
    2.4.5 水接触角(WCA)  41-42
  2.5 材料表征结果与讨论  42-49
    2.5.1 光镜结果  42-43
    2.5.2 扫描电镜(SEM)结果  43-44
    2.5.3 样品XRD表征结果分析  44-45
    2.5.4 样品红外结果分析  45-47
    2.5.5 水接触角(WCA)结果分析  47-49
  2.6 本章小结  49-50
第3章间充质干细胞的提取和鉴定  50-68
  3.1 引言  50-51
  3.2 间充质干细胞(MSC)的提取与培养  51-55
    3.2.1 实验试剂及仪器  51-52
    3.2.2 实验前准备  52
    3.2.3 人脐带间充质干细胞的提取与培养  52-54
    3.2.4 SD大鼠骨髓间充质干细胞的提取与培养  54-55
  3.3 MSC的表征和鉴定方法  55-57
  3.4 结果与讨论  57-66
    3.4.1 人脐带间充质干细胞的表征和鉴定  57-62
    3.4.2 SD大鼠骨髓间充质干细胞表征和鉴定  62-66
  3.5 本章小结  66-68
第4章 TiO2纳米管微沟槽对MSC的诱导和初步鉴定  68-91
  4.1 引言  68
  4.2 实验试剂及仪器  68-69
    4.2.1 实验试剂  68-69
    4.2.2 实验仪器与耗材  69
  4.3 数据统计分析  69
  4.4 构建的材料体系对干细胞的短期调控  69-75
    4.4.1 各样品表面MSC的种植  69-70
    4.4.2 各材料体系表面干细胞短期粘附、增殖结果与分析  70-73
    4.4.3 各材料体系表面干细胞形态分析  73-75
  4.5 频繁传代换液的细胞培养方法  75-76
  4.6 各材料体系对干细胞调控与诱导的探索  76-83
    4.6.1 诱导成突触细胞的排查  77-78
    4.6.2 诱导成内皮(祖)细胞的排查  78-80
    4.6.3 诱导成成骨细胞的排查  80-81
    4.6.4 诱导成平滑肌细胞的排查  81-83
  4.7 TiO_2纳米管微沟槽诱导MSC成类SMC的初步鉴定  83-89
    4.7.1 免疫荧光定性分析  83-88
    4.7.2 免疫荧光定量分析  88-89
  4.8 本章小结  89-91
第5章材料诱导MSC定向分化行为的机理分析  91-95
  5.1 材料表面形貌对干细胞的调控影响  91-93
  5.2 展望  93-95
结论  95-97
致谢  97-98
参考文献  98-114
攻读硕士期间发表的论文及参与科研项目  114

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