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血管内皮细胞和α-磷酸三钙促进骨髓基质干细胞成骨分化作用的研究

作　者: 刘金钟
导　师: 孙宏晨
学　校: 吉林大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 骨损伤骨组织工程 α-TCP 血管内皮细胞
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由于肿瘤、外伤、炎症、畸形等因素所造成骨破坏的治疗一直是口腔医学领域的难题，利用组织工程技术构建人工骨进行骨缺损的治疗是目前主要的研究方向之一，而骨组织工程存在的主要问题是所构建的人工骨成骨能力有限。通过建立功能性微血管环境可以满足种子细胞新陈代谢需求，进一步促进新骨形成以及参与细胞间的相互作用。由于血管在骨形成中具有重要作用，使得血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）在骨组织工程中应用被广泛关注，但其来源有限，且不易扩增。骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stemcells，BMSCs)在骨髓中大量存在，容易获取，且有向血管内皮细胞等多向分化的潜能。因此，我们首先分离了兔的BMSCs作为种子细胞，经内皮细胞条件培养液中诱导培养，利用内皮细胞表面标记物CD34免疫组化染色证明其诱导的细胞为血管内皮细胞。体外以单纯BMSCs为对照组，ECs和BMSCs共培养为实验组，通过碱性磷酸酶活性检测、考马斯亮蓝总蛋白测定、碱性磷酸酶和茜素红染色，结果表明，ECs对BMSCs向成骨细胞分化具有促进作用。将共培养的种子细胞接种在PLGA支架材料上，植入直径为1cm的兔下颌骨缺损模型中，通过软X线和组织化学染色分别对4周和8周的实验动物进行观察，结果显示BMSCs可以在PLGA支架材料上生长且材料具有较好的生物相容性且无细胞毒性，诱导的ECs与BMSCs共培养在PLGA支架材料上，同BMSCs对照组比具有明显的促成骨作用及骨缺损修复能力。结果提示血管化组织工程骨有望成为修复大面积骨缺损的有效的途径。磷酸钙是天然骨的主要组成成分，作为骨替代物、人工骨和组织工程的支架等具有较好的应用前景。不同结构的磷酸钙中，羟基磷灰石（HA）和磷酸三钙（TCP）由于对人体生理环境具有较强的生物学反应而受到广泛的关注。由于HA的化学结构稳定使其具有较强的抗吸收作用，但其密度高、脆性大、弹性差等原因限制了其广泛应用。TCP按结构分为高温相(α-TCP)和低温相(β-TCP)，其中α-TCP相对于β-TCP具有更好的生物降解性和生物相容性，并且植入人体后反应温和，基本不产热，降解后被生物体迅速吸收和取代，因此具有良好的生物医学应用前景。本研究通过共沉淀法合成了α-TCP，采用XRD、SEM、TEM等方法评价了其物理学及化学性能。通过与大鼠BMSCs共培养，检测MTT以评价材料的生物安全性，通过Real Time PCR检测ALPase、SP7、RUNX2、COL-Ⅰ等成骨细胞相关因子mRNA的表达，探讨α-TCP在体外对BMSCs成骨作用的影响。结果表明，α-TCP能够上调大鼠BMSCs向成骨细胞分化相关基因的表达，证明α-TCP可以促进BMSCs向成骨细胞分化的作用，这就为其在骨组织工程中的应用提供了一定的理论依据。

全文目录

英文缩略词表  7-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
第1章文献回顾  12-20
  1.1 骨组织工程概述  12
  1.2 基质干细胞  12
  1.3 提高 MSCs 成骨能力的因素  12-20
    1.3.1 应力刺激  12-13
    1.3.2 药物的作用  13-14
    1.3.3 生物活性因子的作用  14-16
    1.3.4 支架材料的作用  16-19
    1.3.5 本研究的思路  19-20
第2章诱导的血管内皮细胞对兔骨髓基质干细胞成骨分化作用的研究  20-30
  2.1 前言  20
  2.2 实验与方法  20-22
    2.2.1 PLGA 支架材料的制备  20
    2.2.2 兔 BMSCs 的分离及 ECs 的诱导分化与鉴定  20-21
    2.2.3 体外构建 BMSCs 和 ECs 共培养模型  21
    2.2.4 碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红(AZR)染色  21
    2.2.5 体内建立兔下颌骨缺损植入模型  21-22
    2.2.6 影像学检测  22
    2.2.7 组织学分析  22
  2.3 实验结果  22-28
    2.3.1 PLGA 支架材料的特性及生物学相容性  22
    2.3.2 BMSCs 的培养  22
    2.3.3 诱导 ECs 的鉴定  22-23
    2.3.4 体外共培养 ECs 对 MSCs 的成骨分化作用  23
    2.3.5 放射线检测结果  23-26
    2.3.6 组织学分析  26-28
  2.4 讨论  28-29
  2.5 结论  29-30
第3章 α -TCP 的制备及其物理化学性能的表征  30-36
  3.1 前言  30
  3.2 实验方法  30-31
    3.2.1 试剂与仪器  30-31
    3.2.2 α -TCP 的制备  31
    3.2.3 实验过程  31
    3.2.4 XRD 测试  31
    3.2.5 SEM 测试  31
    3.2.6 TEM测试  31
    3.2.7 氮气吸附实验  31
  3.3 实验结果  31-34
    3.3.1 XRD 分析  31-32
    3.3.2 SEM 分析  32
    3.3.3 TEM 分析  32-33
    3.3.4 氮气吸附实验分析  33-34
  3.4 讨论  34-35
  3.5 结论  35-36
第4章 α -TCP 对大鼠 BMSCs 成骨分化作用的体外研究  36-46
  4.1 前言  36
  4.2 实验方法  36-39
    4.2.1 α -TCP 的合成  36
    4.2.2 大鼠 BMSCs 的培养  36-37
    4.2.3 MTT 检测  37
    4.2.4 Real-time PCR 的检测  37-39
    4.2.5 茜素红（AZR）染色  39
  4.3 实验结果  39-43
    4.3.1 大鼠 BMSCs 的形态学观察  39-40
    4.3.2 MTT 结果  40
    4.3.3 Real-time PCR 结果  40-41
    4.3.4 茜素红染色结果  41-43
  4.4 讨论  43-45
  4.5 结论  45-46
参考文献  46-54
作者简介及在学期间取得的科研成果  54-55
致谢  55

血管内皮细胞和α-磷酸三钙促进骨髓基质干细胞成骨分化作用的研究

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