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天然牛角材料的生物相容性的初步研究

作　者: 崔兴
导　师: 陈新
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: 生物材料生物相容性细胞毒性溶血急性毒性迟发型超敏反应
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：生物材料在临床中的重要性日益突出，已大量应用于骨科、心血管内科、伤口护理及整形外科等多个领域。天然牛角材料属于生物衍生材料，其主要成分为含有17种氨基酸及无机元素的紧密排列的角蛋白，具有成本低、易于制备、理化性质良好等特点。本实验拟通过对天然牛角材料的生物相容性进行初步研究，从而为其临床应用打下实验基础。方法：天然牛角材料浸提液制备取天然牛角，制备成10mm×5mm×5mm的长方体，经脱脂、超声清洗、高压蒸汽灭菌后置入Eppendof管中加入2.0mL浸提介质（细胞毒性实验浸提介质为RPMI1640培养液，溶血实验、急性毒实验、迟发型超敏反应实验浸提介质为生理盐水），在培养箱中保存3天后收集浸提液并保存。细胞毒性实验细胞形态观察实验：将L929细胞分别用RPMI1640培养液、50%天然牛角材料浸提液及100%天然牛角材料浸提液吹打成单细胞悬液培养、传代，然后分别于24小时、48小时及72h在显微镜下观察L929细胞的形态变化。MTT实验：实验分为空白对照组（RPMI1640培养液）、50%天然牛角材料浸提液组及100%天然牛角材料浸提液组。将L-929细胞制备成细胞悬液接种于96孔板中，置入培养箱中培养24小时后弃去原液，分别加入上述3组溶液再次置入培养箱中培养。分别于培养24小时、48h小时及72小时后取出一块96孔板，加MTT液，加DMSO，在免疫酶标仪上测定492nm处的吸光度（OD）值。溶血实验抽取兔血10ml，加入抗凝剂，制备成符合实验要求的稀释兔血。实验分为阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（蒸馏水）及实验组（天然牛角材料浸提液）。分别取各组溶液10ml，预温30分钟（37℃水浴箱），各加入稀释兔血0.2ml，保温60分钟（37℃水浴箱），离心5分钟，最后在免疫酶标仪上测定540nm处的吸光度（OD）值。急性毒性实验将20只小鼠随机分为两组，实验组小鼠腹腔内注射天然牛角材料浸提液（剂量为50ml/Kg），对照组小鼠腹腔内注射与实验组小鼠同等剂量的生理盐水。注射后立刻观察两组小鼠状态,并称量其体重，并分别于24小时、48小时及72h后重复观察、称重。迟发型实验方法实验分为实验组（天然牛角材料浸提液）、阴性对照组（生理盐水）及阳性对照组（5%甲醛）。诱导阶段:分别将20mm×20mm敷料浸透天然牛角材料浸提液、生理盐水及5%甲醛后局部贴覆在两组动物体上,固定6小时,间隔1周重复该步骤,连续操作3周。激发阶段:最后一次贴覆14天后,再用20mm×20mm敷料浸透相应溶液局部贴覆于动物去毛未试部位,6小时后去除。动物观察:激发接触24小时后观察相应指标。结果：1倒置显微镜下观察发现：在培养24小时、48小时及72小时后，50%、100%天然牛角材料浸提液组与阴性对照组相比，对L929细胞形态及增殖的影响相似。细胞形态呈梭形、三角形或不规则形，贴壁生长良好，胞浆内偶见离散颗粒，无细胞溶解，细胞数目明显增多。2通过多变量方差分析法对MTT实验结果进行统计学分析，得到Wilks,Lambda值为0.736，F值为1.711，P值为0.133>0.05，表明实验组与对照组OD均值在各个时间段内均无统计学差异。在各个时间段、各个实验组计算所得RGR%均>100%，毒性均属0级。3阴性对照组OD均值为0.005，阳性对照组OD均值为0.705，天然牛角材料浸提液OD均值为0.016；天然牛角材料浸提液溶血率（%）=（0.016-0.005）/（0.753-0.005）×100%=0.124%。4实验组及对照组动物一般状况良好，观察期内两组小鼠均无运动减少、呼吸困难、腹部刺激症状、衰竭、发绀和动物死亡等毒性反应。两组小鼠体重均呈上升趋势且通过重复测量方差分析法分析结果显示：实验组与对照组在24小时、48小时及72h不同观察时间内小鼠体重均数均无统计学差异；实验组与对照组在24小时、48小时及72小时三个时间点之间小鼠体重均数均无统计学差异。5用K-W-H秩和检验法对实验结果进行统计学分析：红斑做评价标准，阳性对照组发生红斑的严重程度及发生率均明显大于实验组和阴性对照组(P<0.000);虽然实验组红斑发生率（30%）大于阴性对照组（0%），但是其发生红斑的严重程度较轻且与阴性对照组无统计学差异（P=0.070）。水肿做评价标准，阳性对照组发生水肿的严重程度及发生率均明显大于实验组和阴性对照组(P<0.000);虽然实验组水肿发生率（30%）大于阴性对照组（0%），但是其发生水肿的严重程度较轻且与阴性对照组无统计学差异（P=0.070）。结论:本实验结果表明天然牛角材料无细胞毒性、无溶血作用、无毒性、无明显致敏作用，初步证实了：在本实验条件下，天然牛角材料具有良好的生物相容性。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11
材料与方法  11-15
结果  15-18
附图  18-23
附表  23-28
讨论  28-31
结论  31-32
参考文献  32-34
综述生物材料及其生物相容性评价方法的研究与展望  34-43
  参考文献  40-43
致谢  43-44
个人简历  44

天然牛角材料的生物相容性的初步研究

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