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阿托伐他汀对体外培养大鼠皮层神经元突触相关蛋白表达的影响及其机制

作　者: 郁盛雪
导　师: 金英
学　校: 辽宁医学院
专　业: 药理学
关键词: 阿托伐他汀 神经元 突触素 突触后致密物质-95 磷酸酰肌醇-3激酶 磷酸肌醇依赖激酶
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的探讨阿托伐他汀对体外培养大鼠乳鼠大脑皮层神经元突触相关蛋白表达的促进作用及其相关信号转导机制。方法选用出生24h内的SD大鼠乳鼠，在无菌条件下取出大脑皮层，进行皮层神经元体外培养，神经元培养4d后用于实验。实验分为两部分，第一部分观察阿托伐他汀对突触素和突触后致密物质-95表达的影响。实验分为正常对照组、不同浓度阿托伐他汀处理组、阿托伐他汀处理不同时间组；正常对照组：加入等量含0.1%DMSO培养基；阿托伐他汀处理组：培养4d神经元，加入不同浓度阿托伐他汀（0.1、1、5、10μmol/L）作用48h；阿托伐他汀处理时间组：将阿托伐他汀1μmol/L加入培养4d神经元，分别作用12h、24h、48h、96h。应用倒置相差显微镜、微管相关蛋白-2（MAP2）及β-tubulin免疫荧光染色观察神经元树突和轴突的生长，应用免疫荧光染色法和Western印迹法检测皮层神经元突触素（SYP）、突触后致密物质-95（PSD-95）蛋白表达的改变。第二部分探讨阿托伐他汀对SYP、PSD-95蛋白表达作用的相关信号转导机制。实验分组：正常对照组、阿托伐他汀(10μmol/L)组、阻断剂组、阿托伐他汀+阻断剂组；正常对照组：加入等量含0.1%DMSO培养基；阿托伐他汀(10μmol/L)组：培养4d神经元加入10μmol/L阿托伐他汀作用48h；阻断剂组：将PI3K阻断剂LY303511、LY294002、Akt阻断剂Triciribine（TCBN）、mTOR阻断剂Rapamycin四种阻断剂分别溶解于DMSO中，使用时稀释成LY294002(30μmol/L)、LY303511（20μmol/L）、Triciribine(1μmol/L)、Rapamycin(100nmol/L)分别单独加入培养4d的神经元作用48h；阿托伐他汀+各阻断剂组：加入阿托伐他汀(10μmol/L)前30min分别加入LY294002(30μmol/L)、LY303511(20μmol/L)、Triciribine(1μmol/L)、Rapamycin(100nmol/L)共同作用48h。应用Western印迹法检测阿托伐他汀是否可以对抗各组阻断剂导致的SYP、PSD-95蛋白表达的改变，以推测阿托伐他汀是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响SYP、PSD蛋白表达。应用Western印迹法进一步检测磷酸化-PDK1、磷酸化-Akt、磷酸化-mTOR、磷酸化-p70s6k、磷酸化-4E-BP1蛋白表达的改变明确其信号转导机制。结果神经元形态学观察结果显示，阿托伐他汀(5μmol/L)可促进皮层神经元突起生长，较正常对照组比较表现为突起增多、树突分支增多并相互连接成密集的网络；免疫荧光结果显示阿托伐他汀能够明显增加树突和轴突长度，并可显著上调SYP、PSD-95蛋白表达水平；Western印迹法结果显示，不同浓度阿托伐他汀处理组均能显著增加SYP、PSD-95蛋白表达，呈明显的浓度依赖性，阿托伐他汀(1μmol/L)作用显著（p<0.01）；阿托伐他汀处理不同时间组均可增加SYP、PSD-95蛋白表达，阿托伐他汀(1μmol/L)作用12h即可增加SYP、PSD-95蛋白表达水平（p<0.05），作用96h时SYP表达达高峰（p<0.01），作用48h时PSD-95表达高峰（p<0.01）；阿托伐他汀(10μmol/L)可显著增加SYP、PSD-95蛋白表达（p<0.01）。应用PI3K阻断剂LY294002、Akt阻断剂Triciribine和mTOR阻断剂Rapamycin均能够明显阻断阿托伐他汀引起的SYP、PSD-95蛋白表达水平增加（p<0.01），说明阿托伐他汀导致的SYP、PSD-95蛋白表达水平与PI3K/Akt/mTOR信号转导通路有关。进一步研究证明阿托伐他汀(10μmol/L)也能够显著增加磷酸化-PDK1、磷酸化-Akt、磷酸化-mTOR、磷酸化-p70s6k和磷酸化-4E-BP1蛋白表达水平（p<0.01）。应用PI3K阻断剂LY294002能够阻断阿托伐他汀引起的磷酸化-PDK1、磷酸化-Akt、磷酸化-mTOR、磷酸化-p70s6k和磷酸化-4E-BP1的蛋白表达水平增加（p<0.05）。而应用没有活性的LY294002的类似物LY303511对阿托伐他汀的这种促进作用无影响。应用Akt阻断剂Triciribine能够明显阻断阿托伐他汀对磷酸化-Akt、磷酸化-mTOR的增加作用（p<0.01）。应用mTOR阻断剂Rapamycin能够阻断阿托伐他汀引起的磷酸化-p70s6k蛋白表达水平增加（p<0.05），应用mTOR阻断剂Rapamycin能够显著阻断阿托伐他汀引起的磷酸化-4E-BP1蛋白表达水平增加（p<0.01）。结论阿托伐他汀对体外培养皮层神经元突起发育有促进作用，能够增加SYP、PSD-95表达水平，这种促进作用与激活PI3K/Akt/mTOR信号转导通路有关。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
英文缩略语  11-12
前言  12-14
实验材料与方法  14-17
实验结果  17-30
讨论  30-34
结论  34-35
本研究创新性的自我评价  35-36
参考文献  36-40
综述  40-48
  参考文献  44-48
在学期间科研成绩  48-49
致谢  49-50
个人简历  50-51

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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