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阿托伐他汀对体外培养皮层神经元Rho-GTP酶家族蛋白表达的影响

作 者: 金迎新
导 师: 金英
学 校: 辽宁医学院
专 业: 药理学
关键词: 阿托伐他汀 神经元 突起生长 Rho 异戊二烯
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


目的观察及验证阿托伐他汀(Ato)可促进体外大鼠神经元的生长发育,探讨该作用是否与抑制胆固醇的活性和影响Rho/Rho激酶信号通路有关,进一步探讨阿托伐他汀的作用机制。方法选取出生1d以内的SD大鼠乳鼠,处死后酒精浸泡消毒1分钟,取出并剪碎其大脑皮层,置于培养皿内用0.125%的胰蛋白酶消化处理,行4d的神经元细胞培养后即可用于实验。实验过程如下:第一部分:观察和验证Ato对体外培养的大鼠乳鼠皮层神经元树突生长发育有促进作用。对培养4d的神经元细胞进行分组:正常对照组:加入0.1%的DMSO作用48h;Ato组:加入5μmol/L的Ato作用48h;BDNF组:加入50ng/L的BDNF作用48h。采用倒置相差显微镜对大鼠乳鼠神经元树突生长发育进行观察,测量指标包括:树突分支总长度(TDBL),一级树突数目(PDN)和最大分支级数(MBO)。第二部分:观察Ato是否通过抑制胆固醇和甲羟戊酸的合成促进树突生长发育。对培养4d的神经元细胞进行分组:正常对照组:加入0.1%的DMSO作用48h;Ato组:加入5μmol/L的Ato作用48h;胆固醇组:加入20mg/L的胆固醇作用48h;Ato+胆固醇组:加入20mg/L的胆固醇作用1h后再加入5μmol/L的Ato共同作用48h;Mevalonic acid组:加入1mmol/L的Mevalonic acid作用48h;Ato+Mevalonic acid组:加入1mmol/L的Mevalonic acid作用1h后再加入5μmol/L的Ato共同作用48h。采用倒置相差显微镜对大鼠乳鼠神经元树突生长发育进行观察,测量指标包括:树突分支总长度(TDBL),一级树突数目(PDN)和最大分支级数(MBO)。第三部分:观察Ato是否通过抑制类异戊二烯产生促进树突生长发育。对培养4d的神经元细胞进行分组:正常对照组:加入0.1%的DMSO作用48h;Ato组:加入5μmol/L的Ato作用48h;GGPP组:加入20μmol/L的GGPP作用48h;Ato+GGPP组:加入20μmol/L的GGPP作用1h后,再加入5μmol/L的Ato共同作用48h。采用倒置相差显微镜对大鼠乳鼠神经元树突生长发育进行观察,测量指标包括:树突分支总长度(TDBL),一级树突数目(PDN)和最大分支级数(MBO)。第四部分:观察Ato对Rho-GTP酶蛋白表达的影响。对培养4d的神经元细胞进行分组:正常对照组:加入0.1%的DMSO作用12h;Ato(1μmol/L)组:加入1μmol/L的Ato作用12h;Ato(5μmol/L)组:加入5μmol/L的Ato作用12h。应用蛋白免疫印迹(Western blot)的方法分别观察RhoA、Cdc42、Rac蛋白表达的改变。结果第一部分:应用倒置显微镜观察显示Ato(5μmol/L)可明显促进大鼠乳鼠神经元树突发育,表现为TDBL增加、PDN增多、MBO增大。第二部分:应用倒置显微镜观察显示Ato促进神经元突起生长作用不能被加入胆固醇所阻断,说明其促进突起生长作用与其降低胆固醇作用无关。单独应用胆固醇对神经元树突生长没有影响。然而,在加入Ato前加入甲羟戊酸可明显抑制Ato的促进突起生长作用,说明其促进突起生长作用与抑制甲羟戊酸合成有关。单独应用甲羟戊酸对神经元突起生长发育影响不明显。第三部分:类异戊二烯脂类物质(包括GGPP和FPP)的合成与甲羟戊酸有关,为了确定Ato促进树突生长发育作用是否与抑制类异戊二烯有关,在加入Ato前1h,加入了GGPP,结果显示Ato促进树突生长作用几乎完全被GGPP所拮抗,提示Ato促进树突生长与抑制类异戊二烯产生密切相关。单独应用GGPP对神经元突起生长发育影响并不明显。第四部分:应用蛋白免疫印方法迹检测大鼠乳鼠神经元细胞膜RhoA的表达水平,结果显示Ato(1,5μmol/L)处理培养神经元12h可使细胞膜RhoA的蛋白表达水平较正常对照组明显降低。同时,应用蛋白免疫印迹方法检测神经元提取物Cdc42、Rac的蛋白表达水平,结果显示Ato(1,5μmol/L)处理培养神经元12h较正常对照组明显增加。两组结果分别提示Ato促进神经元树突生长发育作用与抑制RhoA的表达,增加Cdc42、Rac蛋白表达有一定关系。结论阿托伐他汀是通过抑制甲羟戊酸合成,进而抑制类异戊二烯的生成,从而使Rho-GTP酶RhoA活性降低,增加Cdc42、Rac蛋白表达来促进神经元树突的生长。

全文目录


中文论著摘要  4-7
英文论著摘要  7-10
英文缩略语  10-11
前言  11-13
实验材料与方法  13-17
实验结果  17-26
讨论  26-29
结论  29
本研究创新性的自我评价  29-30
参考文献  30-34
综述  34-42
  参考文献  39-42
在学期间科研成绩  42-43
致谢  43-44
个人简介  44-45

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