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异丙嗪加重双黄连中药注射剂致心律失常作用的研究

作　者: 罗卓卡
导　师: 陈龙
学　校: 南京中医药大学
专　业: 药理学
关键词: 双黄连中药注射剂异丙嗪心电图心律失常 L型钙电流 hNav1.5电流 hERG电流
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的双黄连中药注射剂发生严重不良反应时常采用抗过敏药物异丙嗪进行救治。本研究对异丙嗪用于抢救双黄连中药注射剂引起的严重不良反应患者的方案提出质疑,通过临床前心脏安全性评价实验来验证异丙嗪加重双黄连中药注射剂所致缓慢性心律失常的作用。药品1.异丙嗪：异丙嗪盐酸盐（以下简称异丙嗪）,批号：1001154582,从Sigma-Aldrich公司购买。2.双黄连：注射用双黄连（冻干）（以下简称双黄连）,批号：0910019,国药准字Z10960058,哈药集团中药二厂生产。方法1.豚鼠在体心电图记录豚鼠由20%乌拉坦（5mL/kg）行腹腔注射麻醉,仰卧位固定,分离出一侧颈静脉,行插管,给药。四肢皮下扎入针形电极引导记录Ⅱ导联心电信号,经四道生理记录仪采样并存入计算机。于静脉推注药物5min后记录心电图,分析心率、P-R间期、QRS间期和QTc间期。人体与动物药物用量的转化：按照体表面积系数计算,且按照每公斤体重进行比较,国际标准豚鼠用剂量为人用剂量的4.6倍。按照双黄连说明书所规定的：成人用量为每次60mg/kg,在体实验采用60mg/kg为1倍临床剂量。换算为豚鼠在体1倍剂量为276mg/kg,5倍剂量为1380mg/kg。按照注射用异丙嗪盐酸盐说明书所规定的：抗过敏用量每次25mg,最高量不得超过每次100mg,在体实验中采用临床最高用量100mg/60kg为1倍临床剂量。换算为豚鼠在体1/4倍剂量为1.93mg/kg,1/2倍剂量为3.83mg/kg,1倍剂量为7.67mg/kg,2倍剂量为15.33mg/kg,5倍剂量为38.33mg/kg。2.豚鼠离体心电图记录采用改进的Langendoff灌流系统,经主动脉进行离体心脏灌流,心脏复跳后在心外膜下置3根银丝电极：正极置于心尖处,负极置于右心房,接地电极置于主动脉根部,引导出离体心脏心电图。待豚鼠心脏跳动稳定后,信号经四道生理记录仪输入计算机记录,分析心率、P-R间期、QRS间期和QTc间期。离体实验药物浓度的计算方法：双黄连的说明书规定成人用量为60mg/kg。按成人体重60kg为例计算,一次用量为3600mg；成人细胞外液约为12000ml（按体重的20%算）,因此换算成临床血药浓度即为0.3g/L。据上述方法换算后,离体实验的组织和细胞灌流液1倍临床浓度为0.3g/L,10倍临床浓度为3g/L。3.豚鼠乳头肌动作电位记录豚鼠腹腔注射20%乌拉坦（5mL/kg）进行麻醉后,快速开胸取出心脏,置于0～4℃无钙灌流液中使之停搏,修剪,取出左心室乳头肌1条,将其固定于恒温浴槽底部。充以95%O2+5%CO2饱和的含钙台氏灌流液,在恒温（36±0.5℃）下以5mL/min的速度恒速灌流,标本在浴槽内稳定1小时后进行实验。给予强度为1.5倍阈值,波宽10ms,刺激频率1Hz的方波刺激。信号经四道生理记录仪输入计算机记录。4.大鼠左心室肌细胞L型钙电流记录采用改良的酶解法分离获取大鼠单个心室肌细胞。无钙灌流液（mmol/L）:NaCl117, KCl5.7, NaHCO34.4, NaH2PO41.5, MgCl21.7, HEPES20, Glucose20, Taurine10, pH用NaOH调至7.4。KB液组成为为（mmol/L）:L-glutamic acid50, KCl40, KH2PO420, Taurine20, MgCl2·6H2O3, KOH70, EGTA0.5, HEPES10, Glucose10. pH用NaOH调至7.4采用膜片钳全细胞记录方法,在室温（20-22℃）下进行。将细胞悬液数滴加入倒置显微镜上的灌流槽中（RC-26, Recording Chamber150μL, USA）,细胞贴壁后,用电流记录外液灌流。选取边缘无卷曲,横纹清晰,表面无颗粒,无收缩的细胞进行封接实验。玻璃毛细管（Sutter instrument O.D.1.5mm, I.D.1.1mm with filament）经微电极拉制仪制成尖端直径约为1μm的电极,电极充灌电流记录内液后,入水阻抗约为5MΩ。调节三维操纵器使电极尖端移向细胞表面进行封接,阻抗达到1GΩ以上后补偿快电容,并给予负压破膜形成全细胞记录模式,调节慢电容补偿和串联电阻补偿,以减少瞬时充放电电流和钳制电位误差。钳制电压为-80mV,阶跃到-40mV并维持200ms（使Na+电流失活）,然后施加到0mV、300ms的试验电压。在电压钳制模式下,记录用药前后L型钙通道的变化。电极记录外液组成为（mmol/L）:NaCl132, CsCl5.4, CaCl21.8, MgCl2·6H2O1.8, NaH2PO4·2H2O0.6,4AP5, HEPES10, glucose·H2O10, Na-pyruvate5. pH用NaOH调至7.4。电极记录内液组成为（mmol/L）:CsC1130, MgCl2·6H2O2, EGTA11, HEPES2O, glucose·H2O10, Na2ATP2, GTP0.1.pH用NaOH调至7.4。5.全细胞电压钳记录hNav1.5电流合成的hNavl.5cDNA（NM₀00335.4）被克隆到带有G418耐药性表达载体pcDNA3.1。构成的质粒在脂质体2000转染试剂作用下,转染至HEK （human embryo kidney）细胞系中。在Dulbecco’s改进的Eagle培养基上培养（10%小牛血清和250μg/ml G418）hNav1.5细胞株,通过规范的次代培养以维持最适宜的状态用于hNavl.5电流记录。采用膜片钳全细胞记录方法,在室温（20-22℃）下进行。钳制电压为-80mV,阶跃到-20mV维持20ms。电流信号经膜片钳放大器放大并经数字-信号转换器与计算机对话,信号的发放和采集均由pClamp10.0软件完成。记录外部溶液（mmol/L）:NaCl25,TEACl122,MgCl21,Glucose10,HEPES10,CaC121.8,pH用NaOH调至7.4,渗透压值用sucrose调至290mOsm。记录内部溶液（mmol/L）:CsF129,MgC122,EGTA11,HEPES10,Na2ATP3,pH用CsOH调至7.2,渗透压值用sucrose调至290mOsm。6.全细胞电压钳记录hERG电流合成的1iERG cDNA（NM₀00238.2）被克隆到带有G418耐药性表达载体pcDNA3.1。构成的质粒在脂质体2000转染试剂作用下,转染HEK （human embryo kidney）细胞系中。在Dulbecco’s改进的Eagle培养基上培养（10%小牛血清和250μg/ml G418）hERG细胞株,通过规范的次代培养以维持最适宜的状态用于hERG电流记录。采用膜片钳全细胞记录方法,在室温（20-22℃）下进行。钳制电压为-80mV,阶跃到-50mV维持50ms,然后施加到50mV4800ms试验电压,最后施加到-50mV5000ms试验电压。电流信号经膜片钳放大器放大并经数字-信号转换器与计算机对话,信号输入经过1kHz的滤波,信号的发放和采集均由pClamp10.0软件完成。电极记录外部溶液（mmol/L）:NaCl137, MgCl21.2, KCl5.4, Glucose10, HEPES10, CaCl22, pH用NaOH调至7.4,用sucrose将渗透压值调至290mOsm。电极记录内部溶液（mmol/L）:KCl130,MgC21, HEPES10, Mg-ATP5, EGTA5, GTP0.1,用KOH调至pH7.3,用sucrose将渗透压值调至290mOsm。结果1.异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对豚鼠在体心电图的影响异丙嗪3.83mg/kg（1/2临床剂量）和7.67mg/kg（1倍临床剂量）无明显改变豚鼠在体心电图P-R、QRS、QTc间期及心率（P>0.05）；异丙嗪15.35mg/kg（2倍临床剂量）显著延长QRS间期；异丙嗪38.33mg/kg（5倍临床剂量）显著延长P-R、QRS、QTc间期并且显著减慢心率。双黄连1380mg/kg（5倍临床剂量）显著减慢在体豚鼠的心率（P<0.05）,显著延长P-R、QRS间期（P<0.05）；双黄连1380mg/kg合用异丙嗪7.67mg/kg进一步减慢双黄连作用下的心率（P<0.05）,延长双黄连作用下的P-R、QRS间期；其中合用异丙嗪1.93mg/kg还显著延长QTc间期（P<0.05）。2.异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对豚鼠离体心电图的影响异丙嗪10μmol/L明显减慢离体豚鼠心脏心率（P<0.05）；异丙嗪50μmol/L明显延长QRS间期（P<0.05）和QTc间期（P<0.05）,并且减慢离体豚鼠心脏心率（P<0.05）。双黄连3g/L（10倍临床浓度）显著减慢离体豚鼠的心率（P<0.05）,显著延长P-R间期（P<0.05）；双黄连3g/L+异丙嗪50μmol/L浓度依赖性地进一步减慢心率,延长双黄连作用下的P-R间期,同时显著延长QRS及QTc间期；双黄连3g/L洗脱组与双黄连3g/L+异丙嗪50μmol/L组相比较,能明显加快心率,缩短P-R间期和QTc间期妒<0.05)；双黄连3g/L洗脱组与双黄连3g/L+异丙嗪50μmol/L组相比较,灌流液洗脱进一步加快心率,缩短P-R间期、QTc间期（P<0.05）和QRS间期（P<0.05）。3.异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对豚鼠乳头肌动作电位的影响26μmol/L异丙嗪未出现豚鼠左心室乳头肌动作电位消失。在双黄连3g/L（10倍临床浓度）+异丙嗪26μmol/L浓度下,即出现部分动作电位的消失；用双黄连3g/L洗脱后,动作电位的产生明显改善。双黄连3g/L+异丙嗪26μmol/L浓度下未能改变动作电位的时程。双黄连3g/L、双黄连3g/L+异丙嗪26μmol/L及双黄连3g/L洗脱产生每分钟动作电位的次数分别为（60土0）、（28±6）及（48±8）,3组间比较差异显著（P<0.05）。4.异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对豚鼠左心室肌细胞L型钙电流的影响异丙嗪阻滞大鼠心室肌细胞L型钙电流呈剂量依赖性,其抑制L型钙电流50%的浓度（IC50）为12.6±4.7μmol/L。异丙嗪在双黄连1.5g/L存在的条件下,抑制L型钙电流50%的浓度（IC50）为6.7±2.8μmol/L。5.异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对hNav1.5电流的影响异丙嗪浓度依赖性地抑制了]hNavl.5电流,其IC5o为6.8±0.7μmol/L。异丙嗪在双黄连0.3g/L存在的条件下,抑制hNavl.5电流50%的浓度（IC50）为5.1±0.6μmol/L。6.异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对hERG电流的影响异丙嗪阻滞hERG电流呈剂量依赖性,抑制hERG电流50%的浓度（IC50）为1.5±0.1μmol/L。异丙嗪在双黄连0.3g/L存在的条件下,抑制hERG电流50%的浓度（IC5o）为0.9±0.1μmol/L。结论1.异丙嗪能明显减慢豚鼠在体和离体心脏的心率,其中大剂量或高浓度异丙嗪还明显延长QRS和QTc间期。异丙嗪在高浓度（50μmol/L）下,可使动作电位消失。2.异丙嗪阻滞大鼠心室肌细胞L型钙电流呈浓度依赖性,IC5o为12.6±4.7μmol/L。异丙嗪可剂量依赖性阻滞hNavl.5电流和hERG电流,IC5o分别为6.8±0.7μmol/L和1.5±0.1μmol/L。3.在体与离体心脏实验确证了双黄连可稳定地诱发缓慢型心律失常；合用异丙嗪未起到救治作用；相反地,异丙嗪加重了双黄连中药注射剂减慢心率的作用,更显著地延长了P-R间期以及QRS间期和QTc间期,加重了双黄连致心律失常的作用。双黄连（3g/L）与异丙嗪（26μmol/L）合用,可使豚鼠乳头肌动作电位完全消失。4.在双黄连1.5g/L存在的条件下,异丙嗪抑制大鼠心室肌细胞L型钙电流IC5o为6.7±2.8μmol/L;在双黄连0.3g/L存在的条件下,异丙嗪抑制hNavl.5电流及hERG电流的IC5o分别为5.1±0.6μmol/L和0.9±0.1μmol/L。二者合用增强了对钠和钙电流的抑制作用,是异丙嗪加重双黄连致心律失常的作用机制之一。双黄连与异丙嗪合用对]hERG电流存在抑制作用,但在动作电位实验中未表现出明显的延长作用,可能是其同时抑制hERG电流和L型钙电流的综合表现。

全文目录

摘要  7-12
Abstract  12-17
绪论  17-23
  参考文献  21-23
第一章异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对正常豚鼠在体心电图的影响  23-37
  前言  23
  材料与方法  23-25
  结果  25-32
  讨论  32-34
  结论  34-35
  参考文献  35-37
第二章异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对正常豚鼠离体心脏心电图的影响  37-49
  前言  37
  材料与方法  37-38
  结果  38-44
  讨论  44-47
  结论  47-48
  参考文献  48-49
第三章异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对正常豚鼠乳头肌动作电位的影响  49-57
  前言  49
  材料与方法  49-51
  结果  51-52
  讨论  52-54
  结论  54-55
  参考文献  55-57
第四章异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对正常大鼠心室肌细胞L型钙电流的影响  57-67
  前言  57
  材料与方法  57-59
  结果  59-64
  讨论  64-65
  结论  65-66
  参考文献  66-67
第五章异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对hNav1.5电流的调控  67-75
  前言  67
  材料与方法  67-69
  结果  69-72
  讨论  72-73
  结论  73-74
  参考文献  74-75
第六章异丙嗪及合用双黄连中药注射剂对hERG电流的调控  75-84
  前言  75
  材料与方法  75-77
  结果  77-81
  讨论  81-82
  结论  82-83
  参考文献  83-84
第七章总结与展望  84-86
附录  86-87
综述  87-100
  参考文献  96-100
攻读硕士学位期间取得的学术成果  100-101
致谢  101

异丙嗪加重双黄连中药注射剂致心律失常作用的研究

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