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整合非靶标和靶标代谢组学模式的白念珠菌被膜形成及药物干预机制研究

作　者: 吴海棠
导　师: 朱臻宇
学　校: 第二军医大学
专　业: 药物分析学
关键词: 代谢组学白念珠菌生物被膜氨基酸黄芩素
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

白念珠菌（Candida albicans）常见的条件致病型真菌[1]，可通过多种机制对人体的免疫系统及各种抗真菌药物产生极大的耐受作用，使白念珠菌感染的治疗一直是临床上棘手的难题。近年来，代谢组学技术的发展为表征真菌代谢物调控模式提供了有力手段，并已应用于白念珠菌代谢轮廓的分析。本课题组前期研究发现，氨基酸代谢作为代谢通路调控的重要环节，在白念珠菌形态变化过程中扮演关键角色。本研究在此基础上，联合液质联用和气质联用技术，构建了靶标和非靶标代谢物分析方法，并结合代谢组学数据挖掘和药理效应验证等手段对白念珠菌形态变化以及中药活性单体的抗菌药效机制进行了研究，旨在为真菌代谢组学相关研究提供方法参考。针对氨基酸的极性和质谱响应特征，构建以多孔石墨碳柱为载体的离子对色谱串联飞行时间质谱系统（IP-PGC-TOF/MS），在基质效应、精密度、重复性、回收率、稳定性考察的基础上，利用三种同位素标记的氨基酸内标，建立了白念珠菌中22种关键氨基酸的非衍生化定量分析方法，最低检测限和最低定量限均达到纳克级。此方法的建立为后续的白念珠菌靶标与非靶标研究奠定了基础。以浮游型和被膜型白念珠菌为对象，在已有的GC-MS研究基础上，为开展对极性不挥发代谢物的研究，应用IP-PGC-TOF/MS方法，结合代谢指纹谱技术和定量代谢组学技术，针对白念珠菌的被膜形成机制进行了更深入研究。在非靶标研究发现16个差异代谢物的基础上，通过对白念珠菌胞内22种氨基酸的定量分析，精确刻画了氨基酸的代谢水平变化，发现了一系列和被膜形成相关的代谢生物标志物，主要与鸟氨酸、赖氨酸代谢相关，其中鸟氨酸在生物被膜中明显降低。进一步通过鸟氨酸脱氢酶（ODC）基因敲除菌SPE1的代谢物活性测试和疏水性实验验证了鸟氨酸代谢在生物被膜形成中的关键作用。我们将构建的靶标和非靶标结合的代谢分析方法应用于中药抗菌活性单体黄芩素作用于白念珠菌的代谢调控机制研究。通过GC-MS与IP-PGC-TOF/MS代谢轮廓分析，分别筛选到20个和21个黄芩素给药相关的差异代谢物，主要参与糖酵解、应激反应、氨基酸代谢、三羧酸循环、磷脂代谢、鞘脂代谢等通路，并完成对黄芩素给药组和对照组胞内22个氨基酸的定量，揭示了黄芩素可能通过干扰能量代谢，细胞膜功能以及对感应分子合成的调节起到抗白念珠菌的作用。本论文探索构建的靶标与非靶标结合的代谢组学研究模式成功运用于白念珠菌的研究，相较于传统研究策略，本方法体系具有更灵敏地代谢物识别能力以及更精确的定量能力，可为真菌形态变化和药效机制的代谢组学提供新的思路。

整合非靶标和靶标代谢组学模式的白念珠菌被膜形成及药物干预机制研究

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