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巯基试剂对淀粉样纤维化的分子机制研究

作　者: 李杰
导　师: 曾成鸣
学　校: 陕西师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 鸡蛋清溶菌酶牛血清白蛋白二硫苏糖醇巯基试剂淀粉样纤维化二硫键
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大量证据表明蛋白质和多肽所形成的淀粉样纤维与几十种人类疾病有着密切的关系,如Aβ肽、溶菌酶、胰岛素和α突触蛋白。蛋白质和多肽的淀粉样变性会导致器官的损伤和功能的丧失,最终引发疾病,包括Ⅱ型糖尿病、阿尔兹海默症、帕金森症、家族性血管等一系列由淀粉样沉积所引起的系统淀粉样变性疾病。淀粉样纤维在细胞膜聚集,引起细胞功能损害,最终导致细胞死亡,从而引发各种疾病。淀粉样纤维的形成是一个复杂的过程,多肽在此过程中形成一系列大小,形态不相同的中间物质,包括寡聚体、原纤维和成熟纤维。相关研究证实,寡聚体和原纤维是导致淀粉样纤维具有细胞毒性的主要物质。然而,对于淀粉样变性疾病的确切作用机制仍然没有一个定论。因此探究淀粉样纤维的毒性机制对于预防和治疗相关的淀粉样疾病具有重要的意义。本文选用鸡蛋清溶菌酶(HEWL)和牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象,探索巯基试剂对这两种蛋白质纤维化的作用。实验结果表明,不同的巯基试剂对蛋白质淀粉样纤维化可产生不同的影响。本文主要研究了二硫苏糖醇(DTT)对蛋白质淀粉样纤维生长的动力学机制和纤维的形态、物理性质以及细胞毒性的影响。结果显示DTT对溶菌酶淀粉样纤维化具有较强的抑制作用。这种作用与DTT本身含有的巯基结构有关。在溶菌酶分子天然结构改变产生聚集和纤维化的过程中,DTT分子的巯基与溶菌酶中的二硫键作用改变了多肽的构象,从而改变了溶菌酶纤维化的进程。但巯基试剂对于BSA的抑制作用很弱,这可能是由于BSA的分子量较大及其特定的结构造成的。实验方法和结果：1、 HEWL的纤维化生长动力学采用ThT (Thioflavin)荧光实验测定蛋白质的淀粉样纤维生长过程,原理是ThT和蛋白质中的p-折叠结构发生特异性结合,通过间接检测β-折叠结构的变化绘制蛋白质的纤维生长曲线。HEWL纤维化过程呈现出“S”型曲线。说明溶菌酶的纤维生长曲线包括延滞期、生长期和稳定期。2、不同种类的巯基试剂对HEWL的影响分别将相同浓度的不同种类的巯基试剂加入HEWL中进行孵育,采用荧光实验检测其影响,结果表明DTT对HEWL纤维化的抑制作用较明显,其他几种巯基试剂对HEWL的作用不明显。而巯基试剂对BSA的抑制作用很弱。3、不同浓度的DTT对HEWL的纤维化作用取一系列不同浓度的DTT加入到溶菌酶中进行孵育,ThT荧光分析表明,DTT对溶菌酶纤维化的抑制作用与浓度呈正相关。1mM DTT可以对溶菌酶纤维的生长产生完全抑制,0.5mM DTT可以对溶菌酶纤维的生长产生部分抑制。非变性电泳实验结果表明,加入1mM和0.5mM DTT的溶菌酶样品中,大分子聚合物含量明显降低。4.不同时期加入DTT对HEWL纤维化的作用探索将DTT在HEWL纤维化过程的不同阶段加入,荧光实验、圆二色谱结果表明,巯基试剂对HEWL的抑制作用与对纤维的作用时间有关,越早加入巯基试剂,抑制作用越明显,1、3、5天加入DTT对纤维化所产生的抑制作用远大于在7、9天加入,说明DTT对纤维的抑制作用发生在纤维生长的成核期。另外变性电泳实验结果说明,纤维可以导致细胞膜蛋白沉积,DTT抑制纤维化过程,所以能够抑制纤维对细胞膜的沉积作用。5.巯基试剂对成熟HEWL纤维的作用将不同浓度的DTT,半胱氨酸,谷胱甘肽分别加入成熟的HEWL纤维中孵育,取样进行ThT荧光检测,实验结果表明DTT对成熟纤维有一定的解聚作用,其解聚作用与浓度呈正相关,而与温度无关。其他巯基试剂对HEWL的解聚作用不明显。6.BSA的纤维生长动力学及巯基试剂对其纤维化的作用。BSA纤维的生长曲线与鸡蛋清溶菌酶纤维所呈现出的“S”型曲线不同。它的纤维化过程没有经历延滞期,说明牛血清白蛋白的纤维化过程无成核期。将不同浓度的DTT,半胱氨酸,谷胱甘肽加入到BSA中进行孵育,ThT荧光分析表明巯基试剂对BSA的纤维化的抑制作用很弱。结论：HEWL和BSA在孵育条件下,都能够形成淀粉样纤维。但是形成纤维的过程不同,BSA的纤维化过程不经历成核期；HEWL的纤维化过程伴随的二硫键断裂及巯基暴露更明显,这是由于两种蛋白的结构及分子量不同造成的。DTT对HEWL的纤维化具有抑制作用,抑制作用与浓度呈正比。在孵育初期加入DTT抑制作用较明显,证实DTT主要是在蛋白质聚集的早期,即成核期产生抑制。电泳实验说明DTT可以抑制HEWL纤维对细胞膜蛋白的沉积作用。另外,DTT能够破坏成熟的溶菌酶纤维。在HEWL分子高级结构改变,产生聚集和纤维化的过程中,DTT分子的巯基通过与HEWL的二硫键作用改变了多肽的构象,从而改变了HEWL纤维化的进程。本文的实验结果说明,类似于DTT结构的巯基化合物可作为一些蛋白质和多肽淀粉样纤维化的抑制剂,也可能作为药物用于蛋白质淀粉样病变的治疗。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-12
第1章引言  12-32
  1.1 论文的选题背景、研究意义及创新之处  12-14
    1.1.1 论文的选题背景  12-13
    1.1.2 论文选题的研究意义  13
    1.1.3 论文的创新之处  13-14
  1.2 淀粉样纤维的研究状况  14-18
    1.2.1 淀粉样纤维的发现及特点  14
    1.2.2 淀粉样纤维相关的疾病  14-15
    1.2.3 淀粉样纤维的形成及毒性机制  15-17
    1.2.4 淀粉样变性病的相关治疗方法  17-18
  1.3 蛋白质纤维化的研究状况  18-23
    1.3.1 蛋白质的纤维化  18-19
    1.3.2 鸡蛋清溶菌酶及其淀粉样纤维的研究  19-21
    1.3.3 牛血清白蛋白的研究及其纤维化的研究进展  21-22
    1.3.4 二硫键对蛋白淀粉样纤维化及细胞毒性的影响  22-23
  1.4 巯基试剂  23-25
    1.4.1 谷胱甘肽  23-24
    1.4.2 L-半脫氨酸  24
    1.4.3 二硫苏糖醇  24-25
  1.5 红细胞及红细胞膜的结构  25-27
  1.6 淀粉样纤维的研究技术  27-32
    1.6.1 荧光检测技术  27-28
    1.6.2 圆二色谱(CD)技术  28-29
    1.6.3 透射电子显微(TEM)技术  29
    1.6.4 蛋白质中巯基含量的测定  29-31
    1.6.6 非变性电泳技术(Native-PAGE)  31-32
第2章实验部分  32-38
  2.1 试剂配制与仪器  32-35
    2.1.1 实验试剂  32
    2.1.2 实验试剂的配制  32-35
    2.1.3 实验仪器  35
  2.2 实验方法  35-38
    2.2.1 样品的制备  35-36
    2.2.2 红细胞及细胞膜的分离  36
    2.2.3 ThT荧光检测  36
    2.2.4 ANS荧光检测  36-37
    2.2.5 透射电子显微镜观察纤维的形态  37
    2.2.6 圆二色谱检测  37
    2.2.7 电泳检测  37
    2.2.8 统计学处理  37-38
第3章实验结果  38-58
  3.1 巯基试剂对鸡蛋清溶菌酶的作用  38-51
    3.1.1 荧光检测鸡蛋清溶菌酶的纤维化过程  38-39
    3.1.2 溶菌酶纤维化过程中的巯基含量变化  39-40
    3.1.3 荧光检测二硫苏糖醇(DTT)对鸡蛋清溶菌酶纤维化的影响  40-42
    3.1.4 圆二色谱检测DTT对溶菌酶纤维化的影响  42-46
    3.1.5 电泳实验检测DTT对溶菌酶纤维化的作用  46-48
    3.1.6 DTT对成熟纤维的影响  48-50
    3.1.7 透射电镜(TEM)观察溶菌酶纤维的形态  50-51
  3.2 巯基试剂对牛血清白蛋白纤维化的作用  51-58
    3.2.1 ThT检测牛血清白蛋白的纤维化过程  51-53
    3.2.2 BSA纤维化过程中分子巯基含量变化  53-54
    3.2.3 ThT荧光检测巯基试剂对牛血清白蛋白纤维化的影响  54-55
    3.2.4 圆二色谱检测巯基试剂对牛血清白蛋白纤维化的影响  55-58
第4章分析与讨论  58-60
  4.1 溶菌酶及牛血清白蛋白纤维的形成及构象变化的检测  58
  4.2 巯基试剂对两种蛋白的纤维化作用  58-60
第5章结论  60-62
参考文献  62-69
致谢  69-70
攻读硕士学位期间的研究论文  70

巯基试剂对淀粉样纤维化的分子机制研究

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