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基于药代动力学及对MRP1功能的影响探讨异硫氰酸烯丙酯治疗COPD的机制

作　者: 曹银
导　师: 汪电雷
学　校: 安徽中医药大学
专　业: 药剂学
关键词: 异硫氰酸烯丙酯慢性阻塞性肺疾病治疗作用药代动力学多药耐药相关蛋白1 功能表达
分类号: R969.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：研究白芥子挥发油主要成分异硫氰酸烯丙酯对COPD模型大鼠的治疗作用，并从异硫氰酸烯丙酯在大鼠体内的药代动力学及其体外对人支气管上皮细胞多药耐药相关蛋白1（MRP1）功能和表达的影响，阐明异硫氰酸烯丙酯治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）作用机制。方法：1）采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，通过气相色谱法测定异硫氰酸烯丙酯含量。2)采用烟、二氧化硫定量熏吸并复合木瓜蛋白酶雾化吸入法，建立COPD模型大鼠，观察异硫氰酸烯丙酯治疗前、后肺功能改变。3)采用超高效液相色谱法（UPLC）测定生物样品中异硫氰酸烯丙酯含量；灌胃、静脉给予异硫氰酸烯丙酯（20mg/kg）后，估算绝对生物利用度、药动学参数以及考察静脉给药后主要组织分布情况。4)采用体外培养人支气管上皮细胞，用MTT法检测异硫氰酸烯丙酯对人支气管上皮细胞的抑制效应，用RT-PCR、Western blot和流式细胞仪等方法检测异硫氰酸烯丙酯对人支气管上皮细胞MRP1的基因、蛋白和功能水平的影响。结果：1)建立了气相色谱法测定白芥子挥发油中异硫氰酸烯丙酯含量的方法。异硫氰酸烯丙酯在10～100μg/mL范围内线性关系良好（r=0.9996）；平均加样回收率分别为97.64%（RSD=2.39%）；含量为7.36%。2)与正常组比较，模型组大鼠的肺顺应性、第0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）/用力肺活量（FVC）、呼气流量峰值（PEF）、最大呼气中段流量（MMF）都显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，治疗组肺顺应性（CL）、第0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）/用力肺活量（FVC）、呼气流量峰值（PEF）、最大呼气中段流量（MMF）明显升高（P＜0.05）。3）建立了生物样品中异硫氰酸烯丙酯UPLC测定法。异硫氰酸烯丙酯在0.156～40.0μg/mL浓度范围，其线性关系良好，r=0.9989，血浆定量下限为0.156μg/mL，血浆中平均回收率为91.34%。大鼠静脉注射20mg/kg异硫氰酸烯丙酯后其消除半衰期为77.36±8.43min，清除率为9.73±0.68mL/min，MRT为109.22±15.54min，AUC0-t为2272.04±111.06min·μg/mL；大鼠口服20mg/kg异硫氰酸烯丙酯后其消除半衰期为107.46±5.42min，清除率为0.01±0.0075L/min/kg，MRT为323.14±2.31min，AUC0-t为1891.65±87.36min·μg/mL；其体内绝对生物利用度为84.95%。大鼠静脉注射异硫氰酸烯丙酯后，广泛分布于各组织中，主要分布于肾、肺、肝脏、胃、心、脾、肌肉、脑次之。4）采用MTT法检测异硫氰酸烯丙酯对人支气管上皮细胞的抑制作用，通过细胞抑制率算出IC50为35.86±0.037μM。通过实验发现异硫氰酸烯丙酯在1～40μM时16HBE14o-细胞MRP1的mRNA水平相应增加；在5～40μM时16HBE14o-细胞MRP1的蛋白水平发生相应剂量上调；同时，在5～40μM时16HBE14o-细胞MRP1转运体功能也发生相应上升。结论：异硫氰酸烯丙酯通过改善COPD模型大鼠的肺功能，而对COPD发挥治疗作用，其机制与异硫氰酸烯丙酯在大鼠体内具有较高的生物利用度，并在肺组织中有广泛分布，以及能够上调人支气管上皮细胞MRP1功能和表达有关。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
中英文缩略词表  12-14
前言  14-19
第一章气相色谱法测定白芥子挥发油中异硫氰酸烯丙酯的含量  19-24
  1 材料  19
    1.1 实验药材  19
    1.2 实验仪器  19
    1.3 药品与试剂  19
  2 方法与结果  19-22
    2.1 白芥子挥发油的提取  19-20
    2.2 含量测定  20-22
      2.2.1 色谱条件  20
      2.2.2 对照品溶液的制备  20
      2.2.3 供试品溶液的制备  20
      2.2.4 系统适用性试验  20-21
      2.2.5 线性考察  21
      2.2.6 精密度试验  21
      2.2.7 重复性试验  21-22
      2.2.8 加样回收率试验  22
      2.2.9 稳定性试验  22
      2.2.10 挥发油含量测定  22
  3 讨论  22-23
  4 小结  23-24
第二章异硫氰酸烯丙酯对 COPD 模型大鼠的治疗作用  24-28
  1 材料  24-25
    1.1 动物  24-25
    1.2 药品与试剂  25
    1.3 实验仪器  25
  2 实验方法  25-26
    2.1 大鼠 COPD 模型的建立  25
    2.2 分组及给药  25
    2.3 大鼠呼吸功能检测  25-26
  3 实验结果  26-27
    3.1 大鼠症状  26
    3.2 各组大鼠肺功能指标比较  26-27
  4 讨论  27
  5 小结  27-28
第三章异硫氰酸烯丙酯在大鼠体内的药动学及组织分布研究  28-41
  1 生物样品中异硫氰酸烯丙酯 UPLC 测定方法的建立与考证  29-33
    1.1 材料  29
      1.1.1 实验动物  29
      1.1.2 实验仪器  29
      1.1.3 药品与试剂  29
    1.2 方法与结果  29-33
      1.2.1 色谱条件  29
      1.2.2 异硫氰酸烯丙酯标准液的配制  29
      1.2.3 生物样品的处理  29-30
      1.2.4 分析方法的验证  30-33
        1.2.4.1 方法的专属性  30-32
        1.2.4.2 线性范围及定量下限  32
        1.2.4.3 提取回收率  32
        1.2.4.4 精密度与准确度  32-33
        1.2.4.5 稳定性  33
  2 异硫氰酸烯丙酯在大鼠体内的药动学研究  33-36
    2.1 色谱条件  33
    2.2 剂量选择依据  33-34
    2.3 动物实验过程  34
    2.4 实验结果  34-36
      2.4.1 血药浓度-时间数据  34-35
      2.4.2 药动学参数  35-36
  3 异硫氰酸烯丙酯在大鼠组织中的分布实验研究  36-38
    3.1 材料  36
    3.2 异硫氰酸烯丙酯标准溶液的配制  36
    3.3 给药方案与样品采集  36-37
    3.4 样品处理方法  37
    3.5 色谱条件  37
    3.6 组织标准曲线的制备  37
    3.7 样品测定结果  37-38
  4 讨论  38-39
  5 小结  39-41
第四章异硫氰酸烯丙酯对人支气管上皮细胞上 MRP1 功能和表达的影响  41-57
  1 材料  41-46
    1.1 细胞株  41-42
    1.2 主要试剂  42-43
    1.3 试剂的配制  43-45
    1.4 主要仪器  45-46
  2 试验方法  46-50
    2.1 16HBE14o-细胞培养及传代  46
    2.2 药物配制  46
    2.3 MTT 法检测细胞活性  46-47
    2.4 RT-PCR 技术分析 MRP1 的 mRNA 基因表达  47-48
    2.5 Western blot 技术分析 MRP1 蛋白表达  48-49
    2.6 流式细胞仪检测荧光强度  49
    2.7 统计方法与处理  49-50
  3 实验结果  50-55
    3.1 异硫氰酸烯丙酯对细胞活性的影响  50
    3.2 异硫氰酸烯丙酯对细胞 MRP1 基因表达的影响  50-51
    3.3 异硫氰酸烯丙酯对细胞 MRP1 蛋白表达的影响  51-52
    3.4 异硫氰酸烯丙酯对细胞 MRP1 功能改变的影响  52-55
  4 讨论  55-56
  5 小结  56-57
第五章总结  57-59
  1 气相色谱法测定白芥子挥发油中异硫氰酸烯丙酯的含量  57
  2 异硫氰酸烯丙酯对 COPD 模型大鼠的治疗作用  57
  3 异硫氰酸烯丙酯在大鼠体内的药动学及组织分布研究  57-58
  4 异硫氰酸烯丙酯对支气管上皮细胞上 MRP1 功能和表达影响  58-59
参考文献  59-67
综述  67-75
  参考文献  72-75
个人简历  75
攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  75-77
致谢  77

基于药代动力学及对MRP1功能的影响探讨异硫氰酸烯丙酯治疗COPD的机制

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