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甲基-β-环糊精及脂筏对细胞膜磷脂PIP2代谢的影响及分子机制研究

作 者: 张熙东
导 师: 张海林
学 校: 河北医科大学
专 业: 药理学
关键词: PIP2 PKC 细胞膜电位 渗透压 脂筏 甲基-β-环糊精 Caveolin-1
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
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内容摘要


细胞膜是细胞进行物质交换和信息传递的重要通道,细胞在接受刺激后,众多的信号通路同时在细胞膜上发生,细胞膜上必然存在着协调不同通路转导的区域。脂筏就是参与信号转导的平台之一。脂筏是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,与膜的信号转导以及蛋白质分选均有密切关系。脂筏中的小窝区域是一个去污剂不溶性膜区域,以存在小窝蛋白分子(caveolin)为特征,可参与细胞胆固醇运输,细胞膜合成,信号传导和肿瘤生成等多种细胞生命活动。目前已知的小窝蛋白有三类:caveolin-1(包括两种变异体α和β),caveolin-2和caveolin-3。研究表明,caveolin-1具有与胆固醇结合能力,并参与了细胞内胆固醇稳态的维持和胆固醇的转运过程。甲基-β-环糊精(M-β-CD)是一种去污剂,能够将细胞膜上的胆固醇从细胞膜抽提出来,从而破坏脂筏的完整性。细胞膜电位是由细胞膜两侧存在的离子浓度差和细胞膜对离子的通透性(离子通道)不同而形成的。不同离子通道在细胞膜上的表达和功能的不同构成了复杂而又规律的细胞电活动。跨细胞膜的电活动可以影响许多细胞活动及功能。在细胞膜有不同的感觉跨膜电活动的蛋白分子,这些分子除显而易见的离子通道蛋白分子外,还有其他一些非生电蛋白分子例如一些酶类。在之前的研究中发现,在卵母细胞中细胞膜去极化可导致PIP2水平升高,这依赖于PKC、PI4K和PLC等酶活性的增强,在这些酶的参与下,磷脂酰肌醇(PIP2)代谢加快并在细胞膜上维持高水平状态,可以使卵母细胞中表达的、功能依赖于PIP2的KCNQ2/Q3钾电流增大。本课题研究开始于我们观察到高渗外液能阻断细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3通道电流的作用。细胞膜去极化导致的细胞膜PIP2合成代谢增加、KCNQ2/Q3功能增强的机制可能与高渗外液改变细胞膜物理性状而影响细胞功能的机制类似。因此,我们针对细胞膜完整性,具体是脂筏在细胞膜电位调节PIP2代谢中的作用及机制展开研究。具体研究内容如下:目的:研究甲基-β-环糊精(M-β-CD)对KCNQ2/Q3电流的影响,由此推测M-β-CD对细胞膜PIP2代谢的影响并对其分子机制进行探索研究;了解细胞膜脂筏在细胞膜电位调节PIP2代谢中作用及分子机制。方法:体外转录的方法制备KCNQ2和KCNQ3通道的cRNA并使之表达于爪蟾卵母细胞;使用双电极电压钳记录表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流,并观察不同实验条件下电流的变化;Western blot检测不同处理组卵母细胞中PI4K和Caveolin-1表达情况。结果:(1) M-β-CD对表达于卵母细胞的KCNQ2/Q3电流有很强的增大作用,其无效类似物α-CD没有增加KCNQ2/Q3电流;(2)PLC阻断剂U73122,PI4K阻断剂PIK93,PKC阻断剂Bis均能阻断M-β-CD增大KCNQ2/Q3电流的的作用;(3) M-β-CD能完全阻断细胞膜去极化以及PMA对KCNQ2/Q3电流的增大作用;(4)NaCl及糖类高渗外液能阻断PMA以及M-β-CD对KCNQ2/Q3电流的增大作用,且对KCNQ2/Q3电流有轻微抑制;(5)细胞外高浓度胆固醇能阻断M-β-CD对KCNQ2/Q3电流的增大作用,且对KCNQ2/Q3电流有强的抑制作用;(6)Western blot结果显示,M-β-CD处理组细胞中PI4K含量显著高于正常对照组,而细胞中Caveolin-1比例显著减少。细胞膜去极化处理组细胞中PI4K含量显著增多但Caveolin-1比例与对照组无显著性差异。结论:实验结果表明M-β-CD明显增大表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流,表明M-β-CD使卵母细胞膜PIP2含量增加。细胞膜去极化导致的细胞膜PIP2合成代谢增加、KCNQ2/Q3功能增强可能与M-β-CD作用的机制类似。细胞膜脂筏结构的完整性可能在细胞膜去极化导致的细胞膜PIP2合成代谢的作用中发挥重要作用。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
英文缩写  9-10
前言  10-12
材料与方法  12-18
结果  18-21
附图  21-29
讨论  29-30
结论  30-31
参考文献  31-34
综述 蛋白激酶 C 的激动剂及其激动机制的概述  34-45
  参考文献  39-45
致谢  45-46
个人简历  46

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