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RGD介导脑靶向阿魏酸脂质体的研究

作　者: 秦晶
导　师: 陈大为
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: 脑靶向 RGD肽 脂质体 阿魏酸 醋酸钙梯度 组织分布 药动学 药效学 缺血/再灌注 抗氧化
分类号: R94
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


炎症在许多神经退行性疾病的发病机理中起着关键性的作用，其中包括局部脑缺血、帕金森病、阿尔茨海默病以及与艾滋病相关的脑水肿。炎症反应过程主要是白细胞(单核细胞和中性粒细胞)通过细胞渗出和趋化性作用跨过血脑屏障(BBB)向炎症部位迅速大量的迁移。在白细胞表面，具有高度表达的整合素受体，RGD肽可以与之特异性地结合。利用这一性质，可将RGD肽与脂质体偶联，使RGD-脂质体被携带跨过BBB并到达脑部的病灶部位。据此，本研究以抗氧化药物阿魏酸(FA)为模型药，通过羧基胆固醇将RGD肽偶联到FA脂质体表面，利用RGD肽与白细胞表面的整合素受体特异性地结合，不仅实现了脑靶向给药，而且将药物直接输送到脑部的病灶区，显著提高了FA的抗氧化效果，达到预期设计目的。相关研究工作的主要内容及结果如下：采用醋酸钙梯度法制备阿魏酸脂质体(FAL)，包封率80.2±5.20％，5h药物释放80％。应用电子顺磁共振技术、电位滴定技术从分子水平研究了药物与磷脂之间的作用，对醋酸钙载药的机理进行初步的探讨。提出从pH梯度和电势梯度两个方面解释其载药机理。选用与FA分子结构相似的水杨酸(SA)为模型药物，制备不同盐梯度脂质体，测定不同盐溶液中FA及SA饱和溶解度，发现内水相中高溶液度也可以获得高包封率。通过胆固醇衍生物将RGD偶联到脂质体表面，以体外细胞亲和力为指标，筛选了RGD与脂质体的连接臂，结果由羧基胆固醇连接的RGD脂质体与白细胞具有更高的亲和力，并确定RGD在脂质体表面的连接密度为2.5％。在人全血中，偶联RGD的脂质体与白细胞结合率达72.4％。考察了羧基胆固醇与RGD偶联工艺的温度、pH值、磷脂浓度等因素对结合率的影响。结果表明98％以上的RGD肽可在2h内反应完全，且催化剂没有引起脂质体的聚集。对偶联RGD的FAL(RGD-FAL)及FAL进行了理化性质评价，冷冻蚀刻电镜观察其显微形态。电镜观察结果为单室脂质体，两种脂质体获得的包封率分别为80.2±5.20％和81.0±3.7％，稳定性良好。采用脑部微量注射IL-1β建立大鼠脑部炎症模型，考察了RGD-FAL脂质体在炎症大鼠体内的分布。结果表明由RGD介导的脑靶向脂质体可以在炎症大鼠的脑组织中以高于FA溶液组6倍，高于FA普通脂质体3倍的浓度分布。且由于RGD脂质体在血中与白细胞的结合，避免了被肝、脾组织的吞噬，与溶液组相比，其半衰期延长了2.6倍，与普通脂质体比较半衰期延长了1.43倍，消除速率明显下降。此外，将荧光标记的RGD脂质体注射入脑部炎症的大鼠体内，不同时间点采用荧光显微镜观察了其脑组织切片，研究RGD脂质体在脑内的分布。荧光照片显示，在炎症反应期脑组织切片的荧光强度持续增加，且出现了荧光脂质体聚集的光斑，证实RGD脂质体在炎症大鼠体内不仅可以随白细胞通过BBB，而且可聚集在脑部的炎症反应病灶。建立U937细胞株氧化损伤模型，以细胞活度、细胞线粒体膜电位的改变及形态学改变为指标评价了RGD-FAL的体外抗氧化活性。结果表明，将FA制成脂质体后，其体外抗氧化能力显著高于FA溶液。建立大鼠脑缺血／再灌注损伤模型，以超氧化物歧化酶、丙二醛以及总抗氧化能力为指标，以川芎嗪为阳性对照药物，评价RGD-FAL在体内的抗氧化效果。结果表明，RGD-FAL在体内抗氧化效果明显高于FA溶液、普通FA脂质体组、阳性对照药物组。结果表明体内药效的结果与体内分布结果具有良好的相关性。

全文目录


中文摘要  16-18
英文摘要  18-20
前言  20-38
  1 脑靶向给药系统的研究进展  20-25
    1.1 化学方法  20-22
      1.1.1 制成前体药物  20-21
      1.1.2 化学传递系统  21-22
    1.2 生物学方法  22
    1.3 制剂学方法  22-25
      1.3.1 脂质体  22-24
      1.3.2 微粒与纳米粒  24-25
      1.3.3 微囊/微球  25
  2 RGD肽在药剂学领域中的应用  25-27
    2.1 肿瘤靶向制剂  25-26
    2.2 血栓靶向制剂  26
    2.3 脑靶向制剂  26-27
  3 FA的研究进展  27-29
    3.1 药理学研究进展  27-29
      3.1.1 抗氧化作用  27-28
      3.1.2 抗炎作用  28
      3.1.3 抗血栓作用  28
      3.1.4 降血脂作用  28
      3.1.5 防治心脏病作用  28-29
      3.1.6 抗癌作用  29
    3.2 FA的理化性质研究  29
    3.3 FA体内药动及分布研究  29
  4 本课题研究方案  29-30
  参考文献  30-38
第一章 阿魏酸脂质体的制备及其理化性质  38-61
  1 仪器与材料  38-39
  2 方法与结果  39-56
    2.1 FA体外HPLC分析方法的建立  39-42
      2.1.1 检测波长的选择  39
      2.1.2 色谱条件的确立  39-40
      2.1.3 标准曲线的绘制  40
      2.1.4 精密度试验  40-41
      2.1.5 回收率试验  41
      2.1.5 专属性试验  41-42
    2.2 FA紫外—可见分光光度分析方法的建立  42-44
      2.2.1 检测波长的选择  42
      2.2.2 标准曲线的绘制  42
      2.2.3 精密度试验  42-43
      2.2.4 回收率试验  43
      2.2.5 专属性试验  43-44
    2.3 脂质体包封率测定方法的建立  44-48
      2.3.1 大孔吸附树脂测定FAL的包封率  44-46
      2.3.2 微柱离心法测定FAL的包封率  46-48
    2.4 FAL的制备方法研究  48-50
      2.4.1 薄膜分散法制备FAL  48
      2.4.2 逆向蒸发法制备FAL  48
      2.4.3 乙醇注入法制备FAL  48-49
      2.4.4 乙醚蒸发法制备FAL  49
      2.4.5 pH梯度法制备FAL  49
      2.4.6 醋酸钙梯度法制备FAL  49-50
    2.5 醋酸钙梯度法制备FAL的工艺考察  50-52
      2.5.1 胆固醇含量对包封率的影响  50
      2.5.2 不同脂药比对包封率的影响  50-51
      2.5.3 电荷对包封率的影响  51
      2.5.4 不同孵育条件对包封率的影响  51-52
      2.5.5 不同钙离子浓度对包封率的影响  52
    2.6 FAL理化性质研究  52-55
      2.6.1 脂质体粒径的测定  52-53
      2.6.2 冷冻蚀刻电镜  53-54
      2.6.3 Zeta电位的测定  54
      2.6.4 FAL体外释放研究  54-55
    2.7 FAL稳定性研究  55-56
      2.7.1 脂质体泄药率的考察  55-56
      2.7.2 脂质体粒径稳定性考察  56
  3 讨论  56-58
    3.1 大孔吸附树脂测定脂质体包封率的讨论  56-57
    3.2 微柱离心法测定脂质体包封率的讨论  57
    3.3 醋酸钙梯度法制备FAL的工艺的讨论  57-58
  4 小结  58-59
  参考文献  59-61
第二章 醋酸钙梯度法包封弱酸性药物的机理研究  61-81
  1 仪器与材料  61
  2 方法与结果  61-72
    2.1 SA体外HPLC分析方法的建立  61-64
      2.1.1 检测波长的选择  61-62
      2.1.2 标准曲线的绘制  62
      2.1.3 精密度试验  62-63
      2.1.4 回收率试验  63
      2.1.5 专属性试验  63-64
    2.2 FA及SA饱和溶解度的测定  64-65
      2.2.1 FA在不同溶剂及不同pH的缓冲盐溶液中饱和溶解度的测定  64
      2.2.2 FA及SA在不同盐溶液中饱和溶解度的测定  64-65
    2.3 醋酸钙梯度法制备水杨酸脂质体(SAL)的研究  65
    2.4 不同盐梯度制备FAL及SAL  65-66
    2.5 不同盐梯度制备FAL及SAL的zeta电位的测定  66-67
    2.6 不同盐梯度制备FAL及SAL粒经分布的测定  67-68
    2.7 不同盐梯度制备的FAL和SAL体外释放行为的研究  68
    2.8 药物lioposome/water分配系数的测定  68-71
    2.9 应用顺磁共振(EPR)研究药物与磷脂的相互作用  71-72
      2.9.1 自旋标记脂质体的制备  71
      2.9.2 自旋标记脂质体的测定  71-72
  3 讨论  72-77
    3.1 电位滴定技术用于FAL的载药分析  72
    3.2 电子顺磁共振技术用于FAL的载药分析  72-73
    3.3 醋酸钙梯度法包封弱酸性药物机理的探讨  73-77
  4 小结  77-79
  参考文献  79-81
第三章 RGD介导脑靶向阿魏酸脂质体制备及体外细胞亲和性  81-108
  1 仪器与材料  82-83
  2 方法与结果  83-100
    2.1 RGD含量测定方法的建立  83-85
      2.1.1 标准曲线的绘制  83-84
      2.1.2 精密度实验  84
      2.1.3 稳定性实验  84-85
      2.1.4 回收率实验  85
      2.1.5 样品含量测定  85
    2.2 RGDL的制备  85-86
    2.3 RGD与RGDL的分离  86-87
    2.4 RGD与脂质体偶联的定性鉴别  87
    2.5 RGD结合率影响因素的考察  87-90
      2.5.1 不同连接臂对肽结合率的影响  87
      2.5.2 RGD与脂质体反应时间对CE的影响  87-88
      2.5.3 CHS与RGD比对CE的影响  88
      2.5.4 反应温度对CE的影响  88-89
      2.5.5 EDC和S-NHS用量对CE的影响  89
      2.5.6 反应pH值对CE的影响  89
      2.5.7 ECD和S-NHS反应时间对CE的影响  89-90
    2.6 荧光磷脂(NBD-PE)含量测定方法的建立  90-91
      2.6.1 NBD-PE标准曲线的建立  90
      2.6.2 精密度  90-91
      2.6.3 回收率  91
    2.7 荧光脂质体的制备  91
    2.8 RGD脂质体与细胞亲和力研究  91-95
      2.8.1 单核细胞的分离  91-92
      2.8.2 中性粒细胞的分离  92
      2.8.3 不同连接臂的RGDL与细胞的结合  92-93
      2.8.4 RGDL的活性测定  93-94
      2.8.5 抑制实验  94-95
      2.8.6 倒置荧光显微镜观察RGDL与细胞的结合  95
    2.9 RGDL在外周血中与单核细胞及中性粒细胞的结合  95-98
      2.9.1 RGDL在外周血中与单核细胞及中性粒细胞的结合率  95-96
      2.9.2 RGD在脂质体表面的密度对细胞结合的影响  96-97
      2.9.3 脂质体浓度对细胞结合的影响  97
      2.9.4 孵育时间对细胞结合的影响  97-98
      2.9.5 孵育温度对细胞结合的影响  98
    2.10 RGDL理化性质研究  98-100
      2.10.1 RGDL粒径的测定  98-99
      2.10.2 RGD偶联对包封率的影响  99
      2.10.3 冷冻蚀刻电镜  99
      2.10.4 RGDL的体外释放研究  99-100
  3 讨论  100-103
  4 小结  103-104
  参考文献  104-108
第四章 RGD介导脑靶向脂质体的体内靶向性  108-124
  1 仪器、试药及实验动物  108-109
  2 RGD-FAL体内分布的研究  109-115
    2.1 样品溶液的制备  109
    2.2 阿魏酸体内分析方法的建立  109-111
      2.2.1 色谱条件的确立  109
      2.2.2 血浆样品的处理  109
      2.2.3 组织样品的处理  109
      2.2.4 方法专属性  109-110
      2.2.5 标准曲线的绘制  110-111
      2.2.6 精密度考察  111
      2.2.7 回收率实验  111
    2.3 RGD-FAL大鼠体内分布的研究  111-112
    2.4 靶向性评价  112-114
    2.5 RGD-FAL大鼠体内药动学研究  114-115
  3 荧光显微镜观察不同处方脑组织切片  115-118
  4 讨论  118-120
    4.1 RODL的脑靶向性  118-119
    4.2 RGD-FAL药动学参数的讨论  119-120
    4.3 荧光标记RGDL的讨论  120
  5 小结  120-122
  参考文献  122-124
第五章 RGD介导脑靶向阿魏酸脂质体体外抗氧化活性  124-132
  1 仪器、试药及实验动物  124
  2 方法与结果  124-128
    2.1 RGD-FAL的制备  124
    2.2 RGD-FAL及FA溶液体外活性考察  124-128
      2.2.1 细胞培养  124-125
      2.2.2 细胞活度测定  125
      2.2.3 细胞形态学变化观察  125-127
      2.2.4 流式细胞分析线粒体膜电位的改变  127-128
  3 讨论  128-129
  4 小结  129-130
  参考文献  130-132
第六章 RGD介导脑靶向阿魏酸脂质体体内药效  132-145
  1 仪器、试剂、动物  132
  2 动物实验方案  132-133
    2.1 I/R模型的复制  132-133
    2.2 神经功能缺损程度评价  133
    2.3 动物分组及给药方案  133
  3 药效学指标的测定  133-138
    3.1 蛋白质含量的测定  133-134
    3.2 SOD活力的测定  134-135
      3.2.1 试剂的配制  134
      3.2.2 组织样品的制备  134
      3.2.3 组织样品SOD活力的测定  134-135
    3.3 MDA含量的测定  135-137
      3.3.1 试剂的配制  135
      3.3.2 组织样品的制备  135
      3.3.3 组织样品MDA含量的测定  135-137
    3.4 T-AOC含量的测定  137-138
      3.4.1 试剂的配制  137
      3.4.2 组织样品的制备  137
      3.4.3 组织样品T-AOC的测定  137-138
  4 讨论  138-140
  5 小结  140-142
  参考文献  142-145
全文结论  145-146
创新点及展望  146-147
缩略语表  147-148
致谢  148-149
攻读博士学位期间发表论文情况  149-150
附录  150-184

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