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靶向细胞dsRNA的重组蛋白dsCARE介导的抗病毒作用

作　者: 王伟
导　师: 颜真
学　校: 第四军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 病毒感染 dsCARE 凋亡 抗病毒
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 9次
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内容摘要


病毒感染会导致多种疾病，长期的病毒感染甚至会诱发细胞癌变；目前常见的抗病毒药物机理主要是干扰病毒DNA、RNA复制或蛋白合成，但是这些药物对正常细胞具有一定毒性，并且病毒的免疫逃逸使药物对病毒的抑制效果降低，因此疗效不是十分理想。dsRNA是病毒感染过程中的普遍特征，目前除了-ssRNA病毒外，几乎所有病毒感染时在细胞质中都能检测到长链dsRNA的存在。因此，研究是否能以dsRNA作为抗病毒药物的靶标，对于寻找新的广谱抗病毒靶点具有十分重要的意义。细胞在受到外源微生物感染时，通常通过清除受感染的细胞而抑制病毒的增殖。在这个过程中，细胞主要通过TLRs和RLRs家族成员识别病毒dsRNA。这些家族蛋白具有一些类似的结构，包括dsRNA结合区和CARD结构域，其效应是导致细胞凋亡。这一理论基础为我们设计抗病毒药物提供了新的思路，我们课题组前期仿照RLRs的结构设计了一种包含dsRNA结合结构域和凋亡诱导结构域的融合蛋白，命名为dsCARE；dsCARE理论上应该能识别dsRNA并发挥诱导细胞凋亡的作用。本课题运用分子生物学的基本实验技术，包括重组表达载体构建、蛋白表达纯化、western blot、免疫荧光、流式细胞术、透射电镜技术以及动物模型建立和病例组织染色等，表达纯化了重组蛋白dsCARE并构建、表达和纯化其截短体，通过不同类型病毒感染细胞模型(ADV、RSV)在细胞水平上验证了dsCARE对病毒感染的防治作用，并揭示了其诱导细胞死亡的机理，通过VACV在动物体内验证了dsCARE的保护作用；dsCARE的有效作用不仅提供了基于dsRNA的抗病毒候选新药研究基础，而且为研究长链dsRNA提供了一种有力工具，为进一步的基础和应用研究提供了基础。第一部分：dsCARE及其截短体的原核表达载体构建、表达及纯化我们采用原核表达载体pRSET和工程菌E.coli BL21(DE3)表达dsCARE、dsCAREΔRBD和dsCAREΔCARD，用Ni-NTA亲和纯化表达的蛋白并柱上复性，最后超滤浓缩。dsCARE在37oC主要以包涵体形式表达，其截短体在37oC在胞质中可溶性表达；实验室条件下每升培养基可收获湿菌体约10g，每10g湿菌体可纯化重组dsCARE约7.5mg，浓度约200-300μg/ml，SDS-PAGE纯度达到95.8%；dsCAREΔRBD浓度约为150μg/ml，dsCAREΔCARD浓度约为330μg/ml。第二部分：dsCARE的抗病毒作用及其机理研究我们选用ADV感染HEK293细胞作为DNA病毒感染模型，RSV感染HEp-2细胞作为负链RNA病毒感染模型，分别用来进行dsCARE保护作用的研究；之后又分别用免疫荧光和流式细胞术检测细胞凋亡，用电镜的方法观察细胞死亡的形态学特点。结果证明dsCARE对DNA病毒和负链RNA感染都有防御作用；dsCARE诱导的细胞死亡包括凋亡的途径，还具有程序性坏死的特征。第三部分：dsCARE在动物体内抗病毒作用研究我们选用VACV感染Balb/c小鼠作为体内实验的动物模型，进行dsCARE保护作用的研究，并且测试在正常小鼠体内给予高剂量dsCARE时的毒性。结果证明dsCARE对小鼠预防病毒感染有明显的保护作用，而且在dsCARE保护下激活没有明显的炎症反应发生，而且高剂量的dsCARE对小鼠没有明显的毒性。

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学
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