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miR-377通过抑制DNMT1促进人皮肤成纤维细胞衰老

作　者: 彭晓敏
导　师: 谢红付
学　校: 中南大学
专　业: 临床医学
关键词: miR-377 DNMT1 皮肤衰老 SIRT1 β-半乳糖苷酶
分类号: R751
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：研究miR-377调节DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1)的表达在人皮肤成纤维(Human skin fibroblasts, HSF)衰老中的作用及机制。方法：1.构建皮肤成纤维细胞复制性衰老模型(n=8)(年青组：p3-5,年老组：p25-30),免疫印迹法(Western-Blot)检测人皮肤成纤维细胞传代衰老模型中DNMT、Sirtl等蛋白的表达,并检测衰老相关p-半乳糖苷酶的活性。2.利用DNMT1siRNA抑制人皮肤成纤维细胞中DNMT1的表达,免疫印迹法(Western-Blot)检测DNMT1、Sirtl等指标的改变,检测衰老相关p-半乳糖苷酶的活性。3.生物信息学网站预测可能与DNMT1的3’UTR区域结合并调控DNMT1的miRNA,初步确定为miR-377能与DNMT1的3’UTR区域结合,可能调控DNMT1的表达。4.使用实时定量PCR (Real-Time PCR)法检测人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中miR-377的表达。5.构建miR-377的过表达病毒载体及抑制慢病毒载体,使用免疫印迹法(Western-Blot)检测转染后细胞DNMT1, Sirtl等蛋白的表达,检测细胞中p-半乳糖苷酶的活性。6.构建DNMT1的3’UTR上miR-377的结合位点序列(野生型)及其突变序列的荧光素酶报告基因重组载体。以探讨miR-377对DNMT1表达的影响。7.收集不同年龄避光部位的皮肤,在体内表皮自然衰老模型、成纤维细胞自然衰老模型中验证miR-377及DNMT1的表达。结果：1.人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中,衰老组与年轻组相比,p-半乳糖苷酶染色率升高(p<0.001)、Sirt1的表达显著下降(p<0.05),说明我们的复制性衰老模型构建成功；DNMT1含量在衰老组的表达明显低于年青组(p<0.05)。2.DNMT1siRNA能显著抑制DNMT1的表达(p<0.05), siRNA处理组与阴性对照组及空白组相比p-半乳糖苷酶染色率明显升高(p <0.01), Sirt1的表达显著下降(p<0.05), DNMT1沉默能使细胞出现衰老表型。3.在人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中,miR-377在衰老组的表达明显高于年轻组(p<0.05)。4.年轻皮肤成纤维细胞中过表达miR-377可使细胞中p-半乳糖苷酶染色率升高(p<0.05), Sirt1表达下降(p<0.05),较空白对照组、阴性对照有统计学意义。在衰老皮肤成纤维细胞中抑制miR-377表达可使p-半乳糖苷酶染色率降低(p<0.05), Sirtl的表达升高(p<0.05),较空白对照组、阴性对照组相比有统计学意义。5、年轻皮肤成纤维细胞中过表达miR-377, miR-377过表达组中DNMT1的表达较空白对照组、阴性对照组明显降低(p<0.05)。而在衰老细胞中抑制miR-377的表达,miR-377抑制组中DNMT1的表达较空白对照组、阴性对照组明显升高(p<0.05)。6.荧光素酶实验结果显示：miR-377与DNMT13’UTR区域存在直接相互作用,miR-377能够调节DNMT1的表达。7.体内实验证明,miR-377在衰老皮肤组织表达明显升高(p<0.05),DNMT1的表达随年龄增加逐步下降(p<0.05)。结论：1.DNMT1在皮肤衰老过程中起重要作用。2.miR-377可以通过直接靶向DNMT13’UTR区,调节DNMT1的表达,从而在皮肤成纤维细胞衰老中起重要作用。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-12
縮略语表  12-13
前言  13-16
第一章 材料和方法  16-33
  1.1 研究对象  16
  1.2 主要实验仪器及试剂  16-19
    1.2.1 主要实验仪器  16-17
    1.2.2 主要实验试剂  17-19
  1.3 主要试剂配制  19-20
  1.4 实验方法  20-32
    1.4.1 细胞培养  20-22
    1.4.2 构建皮肤细胞衰老模型  22
    1.4.3 各种检测方法  22-32
  1.5 统计分析  32-33
第二章 结果  33-47
  2.1 构建人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型  33-34
  2.2 DNMT1的沉默对HSF细胞衰老的影响  34-36
  2.3 生物信息学分析调节DNMT1 mRNA的miRNAs  36-37
  2.4 检测人皮肤成纤维复制性衰老模型中miR-377的表达  37-38
  2.5 构建过表达miR-377及抑制miR-377的人皮肤成纤维细胞  38-39
  2.6 miR-377表达的改变对人皮肤成纤维细胞中衰老影响  39-41
  2.7 miR-377表达的改变对人皮肤成纤维细胞中DNMT1表达影响  41-42
  2.8 DNMT1 3'UTR报告基因载体的构建  42-43
  2.9 miR-377与DNMT1 3'UTR报告基因实验  43-45
  2.10 在体内验证miR-377在人体内衰老皮肤中的表达  45-47
第三章 讨论  47-50
第四章 结论  50-51
参考文献  51-55
综述  55-65
  参考文献  61-65
攻读学位期间主要的研究成果  65-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 皮肤病学与性病学 > 皮肤病学
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